Pestitsidlar global oziq-ovqat tanqisligini bartaraf etishda va vektorlar orqali yuqadigan inson kasalliklariga qarshi kurashishda muhim rol o'ynaydi. Biroq, pestitsidlarga chidamlilikning ortib borayotgan muammosi kam ishlatiladigan nishonlarni nishonga oluvchi yangi birikmalarni kashf etishni zudlik bilan talab qiladi. Hasharotlarning o'tkinchi retseptorlari potentsiali (TRPV) kanallari - Nanzhong (Nan) va nofaol (Iav) - heterologik kanallarni (Nan-Iav) hosil qilishi va hasharotlarda geotropizm, eshitish va propriosepsiyani vositachilik qiluvchi mexanosensor organlarga joylashishi mumkin. Aphidopirrolidon (AP) kabi ba'zi pestitsidlar noma'lum mexanizmlar orqali Nan-Iavni nishonga oladi. AP teshuvchi so'ruvchi hasharotlarga (hemipterans) qarshi samarali bo'lib, filamentlarning funktsiyasini buzish orqali ovqatlanishni oldini oladi. AP faqat Nan bilan bog'lanishi mumkin, ammo faqat Nan-Iav agonistlar, jumladan, endogen nikotinamid (NAM) bilan o'zaro ta'sir qilishi va shu bilan kanal faolligini namoyish qilishi mumkin. Nan-Iavning insektitsid nishoni sifatidagi salohiyatiga qaramay, uning kanal yig'ilishi, tartibga soluvchi bog'lanish joylari va Ca2+ ga bog'liq regulyatsiya haqida kam narsa ma'lum, bu esa insektitsidlarning keyingi rivojlanishiga to'sqinlik qiladi. Ushbu tadqiqotda krio-elektron mikroskopiyasi yordamida Hemiptera hasharotlarida Nan-Iav tuzilishi kalmodulin-ligandsiz holatda, shuningdek, ankirin takroriy sitoplazmatik domeni (ARD) chegarasida AP va NAM bilan aniqlandi. Ajablanarlisi shundaki, biz Nan oqsilining o'zi AP vositachiligidagi ARD o'zaro ta'siri orqali barqarorlashadigan pentamer hosil qilishi mumkinligini aniqladik. Ushbu tadqiqot insektitsidlar va agonistlar hamda Nan-Iav o'rtasidagi molekulyar o'zaro ta'sirlarni ochib beradi, ARDning kanal funktsiyasi va yig'ilishidagi ahamiyatini ta'kidlaydi va Ca2+ regulyatsiya mexanizmini o'rganadi.
Global iqlim o'zgarishi tobora kuchayib borayotgan bir paytda, global oziq-ovqat xavfsizligining yomonlashuvi 21-asrning asosiy muammolaridan biri bo'lib, jamiyat uchun kaskadli oqibatlarga olib keladi.1,2Jahon sogʻliqni saqlash tashkilotining “Dunyoda oziq-ovqat xavfsizligi va ovqatlanish holati 2023” (SOFI) hisobotida dunyo boʻylab taxminan 2,33 milliard kishi oʻrtacha va ogʻir darajadagi oziq-ovqat xavfsizligidan aziyat chekayotgani, bu uzoq vaqtdan beri mavjud boʻlgan muammo ekanligi taxmin qilinmoqda.3,4Afsuski, har yili hosildorlikning taxminan 20% dan 30% gacha yoki undan ko'prog'i zararkunandalar va patogenlar tomonidan yo'qotiladi va global isish zararkunandalarga chidamlilik va ekinlarning zaifligini kuchaytirishi kutilmoqda.4,5,6,7,8Pestitsidlarni ishlab chiqish nafaqat ekinlarni zararkunandalardan himoya qilish va vektor orqali yuqadigan patogenlarning tarqalishini kamaytirish, balki pestitsidlarga tobora chidamli bo'lib borayotgan dengue isitmasi, bezgak va Chagas kasalligi kabi vektor orqali yuqadigan inson kasalliklariga qarshi kurashish uchun ham juda muhimdir.5,9,10,11
Neyrotoksik insektitsidlarning asosiy nishonlari orasida, heterotetramerik TRPV kanali Nanchung (Nan)-Inactive (Iav) so'nggi o'n yillikda kashf etilgan insektitsid nishonlari sinfini ifodalaydi, jumladan, imidakloprid va piraklostrobin kabi tijoratda mavjud bo'lgan insektitsidlar.12,13,14Yarim sintetik aphidopirrolifen insektitsidi (AP) yaqinda ishlab chiqilgan va tijoratlashtirilgan mahsulot bo'lib, uning asosiy komponenti AP ni subnanomolyar faollik darajasida bog'laydigan faol Inscalis® insektitsididir.15AP changlatuvchilar, foydali hasharotlar va boshqa maqsadli bo'lmagan organizmlar uchun past o'tkir toksiklikni namoyon etadi va yorliqdagi ko'rsatmalarga muvofiq ishlatilganda, u boshqa insektitsidlarga qarshilik bosimini kamaytirishi mumkin.16,17,18Nan va Iav hasharot turlari orasida keng tarqalgan, faqat antennalar va oyoq-qo'llarning xordal cho'zilish retseptorlari neyronlarida birgalikda ifodalanadi va eshitish, tortishish kuchini idrok etish va propriotseptsiya uchun juda muhimdir.13,16,19,20,21,22AP, imidakloprid va piraklostrobin Nan-Iav kompleksini noyob mexanizm orqali rag'batlantiradi va natijada proprioseptiv signal o'tkazilishini inhibe qiladi.13,16,23Shira va oq pashsha kabi teshuvchi so'ruvchi hasharotlarda (gemipteranlar) propriotseptsiyaning yo'qolishi ularning ovqatlanish qobiliyatini pasaytiradi va oxir-oqibat o'limga olib keladi.13,24Qizig'i shundaki, AP Nan-Iav kompleksiga yuqori yaqinlik va faqat Nanga past yaqinlik ko'rsatadi. AP ning Nan-Iav ga bog'lanishi elektr tokini keltirib chiqaradi, lekin faqat Nan ga bog'lanish kanal faolligini rag'batlantirmaydi. Iav ning o'zi umuman AP ga bog'lanmaydi.16Bu shuni ko'rsatadiki, Nan va Iav turli xil Nan-Iav kanal komplekslarini hosil qilish uchun bog'lanishi mumkin (masalan, turli stexiometrik nisbatlar yoki bir xil stexiometrik nisbat ichida turli xil tartiblar bilan) yoki AP bir nechta joylarga bog'lanishi mumkin. Bundan tashqari, tabiiy agonist nikotinamid (NAM) Drosophila Nan-Iav ga mikromolyar yaqinlik bilan bog'lanadi va in vitro sharoitida bitlarga (AP) o'xshash ta'sir ko'rsatadi.16,25va unglarning ko'payishi va oziqlanishini inhibe qiladi, natijada ularning o'limiga olib keladi25,26Bu ma'lumotlar ko'plab savollarni tug'diradi. Masalan, Nan-Iav geterodimeri qanday hosil bo'lganligi, kichik molekulalarni modulyatsiya qilish uchun qaysi bog'lanish joylaridan foydalanilganligi va bu kichik molekulalar propriosepsiyani bostirish orqali kanal funktsiyasini qanday tartibga solishi noma'lumligicha qolmoqda. Bundan tashqari, Nanning o'zi faol emasligi va APga past yaqinlikka ega bo'lishining, Nan-Iav geterodimeri esa faol bo'lishi va APga yuqori yaqinlik bilan bog'lanishining sabablari noma'lumligicha qolmoqda. Va nihoyat, Nan-Iav funktsiyasining Ca2+ ga bog'liq regulyatsiyasi va uning neyron signalizatsiya jarayonlariga qanday integratsiyalashganligi haqida kam narsa ma'lum.13,21
Ushbu tadqiqotda, krio-elektron mikroskopiya, elektrofiziologiya va radioligand bog'lash texnikasini birlashtirib, biz Nan-Iav ning yig'ilishini va uning kichik molekulali regulyatorlarga bog'lanish mexanizmini aniqladik. Bundan tashqari, biz Iav va AP bilan stabilizatsiya qilingan Nan pentamerlariga konstitutiv bog'langan kalmodulin (CaM) ni aniqladik. Ushbu natijalar kanallardagi kaltsiy ionlarini tartibga solish, kanal yig'ilishi va ligand bog'lanish yaqinligini belgilovchi omillar haqida muhim tushunchalar beradi. Eng muhimi, biz ARD bu jarayonlarda markaziy rol o'ynashini tasdiqladik. Tegishli qishloq xo'jaligi pestitsidlariga bog'langan to'liq hasharotlar kanallarini o'rganishimiz.27, 28, 29pestitsidlar sanoatini rivojlantirish istiqbollarini ochadi, pestitsidlarning samaradorligi va o'ziga xosligini oshiradi hamda global oziq-ovqat xavfsizligi va vektor orqali yuqadigan kasalliklarning tarqalishi muammolarini hal qilish uchun TRPVga yo'naltirilgan birikmalarni boshqa turlarga qo'llash imkonini beradi.
Shuningdek, biz Nan-Iav Ca2+ tomonidan boshqarilishini va tartibga solish mexanizmi konstitutiv ravishda bog'langan CaM orqali amalga oshirilishini aniqladik. Muhimi, CaM tomonidan Navning Ca2+ ga bog'liq bo'lgan bu tartibga solinishi boshqa ion kanallarini (masalan, kuchlanish bilan boshqariladigan Na+ kanallari va TRPV5/6 kanallari) tartibga solish mexanizmlaridan sezilarli darajada farq qiladi.52,53,54,55,56,57Nav1.2 kanalida CaM ning C-terminal domeni spiral shaklida C-terminal domeni (CTD) bilan bog'lanadi va Ca2+ o'zining N-terminal domenining CTD ning distal qismiga bog'lanishini keltirib chiqaradi.56TRPV5/6 kanalida CaM ning C-terminal domeni CTH ga bog'lanadi va Ca2+ o'zining N-terminal domenini g'ovak ichiga yuqoriga qarab kengayishiga olib keladi va shu bilan kation o'tkazuvchanligini bloklaydi.53,54Biz Nan-Iav-CaM ning Ca2+-regulyatsiyalangan funktsiyasi uchun model taklif qilamiz (4h-rasm). Ushbu modelda CaM ning N-terminal domeni Iav ning C-terminal domeniga (CTH) konstitutiv ravishda bog'lanadi. Tinch holatda (past [Ca2+] konsentratsiyasi), CaM ning C-terminal domeni Nan bilan o'zaro ta'sir qiladi, ARD konformatsiyasini barqarorlashtiradi va shu bilan kanal ochilishini rag'batlantiradi. Agonist/insektitsidning kanalga bog'lanishi teshiklarning ochilishini keltirib chiqaradi, bu esa Ca2+ oqimiga olib keladi. Keyin Ca2+ CaM ga bog'lanadi va Nan ning ARD dan C-terminal domenining dissotsiatsiyasiga olib keladi. CaM bog'lanishini blokirovka qilish Ca2+ ning inhibitiv ta'sirini asosan yo'q qilganligi sababli, bu dissotsiatsiya ARD harakatchanligini modulyatsiya qiladi va shu bilan Ca2+ ga bog'liq inhibisyon yoki desensitizatsiyaga olib keladi. Kaltsiy ionlari elutsiyasidan keyin kanal oqimlarining tez tiklanishi (4g-rasm) bu mexanizm Ca2+ vositachiligidagi neyron signallariga tezkor javob berishni osonlashtirishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, hali ham yaxshi tushunilmagan Iavning C-terminal mintaqasi kanallarni nishonga olish va joriy tartibga solishda boshqa rol o'ynashi haqida xabar berilgan.21
Nihoyat, bizning tadqiqotimiz qishloq xo'jaligida muhim ahamiyatga ega bo'lgan insektitsid-insektitsid TRP kanal kompleksining yuqori aniqlikdagi tuzilishini taqdim etadi - bu kashfiyot bizga ilgari noma'lum edi. Shunisi e'tiborga loyiqki, biz hasharotlar kanalining tuzilishi va funktsiyasini hasharotlar hujayralarida emas, balki inson hujayralarida (HEK293S GnTi–) tavsifladik. Insektitsidlarga qarshilikning ortib borishi va oziq-ovqat xavfsizligi va patogenlarga doimiy bosim ostida, bizning ishimiz inson salomatligi va global oziq-ovqat xavfsizligi manfaatlari uchun yangi insektitsidlarni ishlab chiqishga yordam beradigan muhim ma'lumotlarni taqdim etadi. Tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, AP kabi insektitsidlar yorliqdagi ko'rsatmalarga muvofiq ishlatilganda ba'zi zararkunandalarga qarshi samarali bo'ladi va foydali changlatuvchilar uchun past o'tkir toksiklikka ega, bu ularning ekologik xavfsizligini namoyish etadi.13,16Bundan tashqari, ba'zi AP hosilalarini chivinlarda sinab ko'rish shuni ko'rsatdiki, ular oxir-oqibat uchish qobiliyatini yo'qotadi. Ushbu modulyatsiya qiluvchi birikmalarning Nan-Iav bilan qanday bog'lanishini tushunish mavjud birikmalarni modifikatsiyalashni yoki yanada samaraliroq va samaraliroq qilish uchun yangi birikmalarni ishlab chiqishni osonlashtiradi.aniqzararkunandalarga qarshi kurash. Bizning tadqiqotimiz shuni ko'rsatadiki, Nan-Iav ARD interfeysi nafaqat endogen birikmalar, pestitsidlar va Ca2+-CaM faolligini tartibga solish, balki kanallarni yig'ish uchun ham juda muhimdir. Biz kichik molekulalar bilan heterodimer yig'ilishini buzish ion kanallari ingibitorlarini ishlab chiqish uchun noyob va istiqbolli yondashuv bo'lishi mumkinligini ta'kidlaymiz.
Sakkizta ortologik genlardan jigarrang qo'ng'izning (Halyomorpha halys) to'liq uzunlikdagi genlari tanlab olindi, ular yuvish vositalarida ajoyib barqarorlikni namoyish etdi. Sintezlangan genlar inson ekspressiyasi uchun kodon-optimallashtirildi va XhoI va EcoRI restriction saytlari yordamida pBacMam pCMV-DEST vektoriga (Life Technologies) klonlandi. Bu klonlarning HRC-3C proteazasi (PPX) tomonidan ajratilgan C-terminal GFP-FLAG-10xHis va mCherry-FLAG-10xHis teglari bilan ramkada bo'lishini ta'minladi, bu esa mustaqil ravishda...ifodaNanchung va Inactive ni pBacMam vektoriga klonlash uchun ishlatilgan primerlar quyidagicha edi:
Alohida zarrachalarning mikroskopik tasvirlari K3 kamerasi va Gatan BioQuantum energiya filtri bilan jihozlangan Titan Krios G2 uzatish elektron mikroskopida (FEI) olindi. Mikroskop 300 keV da, energiya sozlamalari 20 eV, namunaviy piksel o'lchami 1,08 Å/piksel (nominal kattalashtirish 81 000x) va defokus gradienti -0,8 dan -2,2 μm gacha bo'lgan holda ishladi. Video yozuv nominal doza tezligi 25 e–px−1 s−1, ta'sir qilish vaqti 2,4 s va umumiy dozasi taxminan 60 e–Å−2 bo'lgan Latitude S mikroskopi (Gatan) yordamida sekundiga 40 kadr tezlikda amalga oshirildi.
RELION 4.061 da MotionCor2 yordamida plyonkada nurlanish bilan bog'liq harakatni to'g'irlash va dozani og'irlashtirish amalga oshirildi. Kontrast uzatish funktsiyasi (CTF) parametrlarini baholash krioSPARCda yamoq asosidagi CTF baholash usuli yordamida amalga oshirildi62. CTF moslashtirish aniqligi ≥4 Å bo'lgan fotomikrograflar keyingi tahlildan chiqarildi. Odatda, krioSPARCda nuqta tanlash uchun 500–1000 fotomikrograflardan iborat kichik to'plam ishlatilgan, so'ngra shablon asosidagi zarrachalarni tanlash uchun aniq mos yozuvlar tasvirini olish uchun filtrlashdan so'ng bir necha bosqichli 2D tasniflash amalga oshirildi. Keyin zarrachalar 64 pikselli chegara qutilari va 4 marta katlama yordamida ajratib olindi. Keraksiz zarracha toifalarini olib tashlash uchun bir necha bosqichli 2D tasniflash amalga oshirildi. Dastlabki 3D model ab initio rekonstruktsiyasi yordamida qayta tiklandi va krioSPARCda notekis tozalash yordamida takomillashtirildi. 3D tasniflash krioSPARC yoki RELIONda ARD heterojenligiga asoslangan holda amalga oshirildi. Membrana domenlarining sezilarli heterojenligi kuzatilmadi. Zarrachalar C1 va C2 usullari yordamida tozalandi; yuqori C2 aniqligiga ega zarrachalar C2 ga nisbatan simmetrik deb hisoblandi va Bayes aniqligi uchun RELION ga import qilindi. Keyin zarrachalar yakuniy notekis va mahalliy aniqlik uchun krioSPARC ga qaytarildi. Yakuniy aniqlik va zarrachalar soni 1-jadvalda ko'rsatilgan.
Nan+AP pentamerlarini qayta ishlashda biz membrana domenlarining (ayniqsa, g'ovak sohasining) aniqligini oshirishning turli usullarini, masalan, signalni ayirish va TMD niqoblash usullarini o'rganib chiqdik. Biroq, bu urinishlar g'ovak sohasidagi potentsial ekstremal tartibsizlik va TMD ning umumiy heterojenligi tufayli muvaffaqiyatsiz bo'ldi. Yakuniy aniqlik asosan ARD sohasini nishonga olgan holda, krioSPARCda notekis ishlov berish usuli bilan avtomatik ravishda yaratilgan niqob yordamida hisoblab chiqildi. Bu membrana domenlariga (ayniqsa VSLD sohasiga) qaraganda ancha yuqori aniqlikka erishdi.
Nanchung va Inactive buglarining apo shakllarining dastlabki de novo modellari dastlab Coot63 yordamida yaratildi va Nan va Iav buglarining modellari past ishonchlilik mintaqalarini aniqlash uchun AlphaFold264 yordamida yaratildi. Kalmodulin modellashtirish mos ravishda 4JPZ56 va 1CFD65 PDB namunalarida Ca2+-bog'lanish va Ca2+-siz modellarning qattiq jismlarga mos kelishiga asoslangan edi. Modellar to'g'ri stereokimyo va yaxshi geometriyani ta'minlash uchun sferik tozalash yordamida takomillashtirildi. Keyin fosfatidilxolin, fosfatidiletanolamin va fosfatidilserin aniq belgilangan lipid zichligi sifatida modellashtirildi va NAM va AP ligandlari tor birikmalardagi mos keladigan zichliklarga joylashtirildi. PHENIX66 da eLBOW yordamida izoformlarning SMILES qatoridan cheklov fayllari yaratildi. Nihoyat, modellar PHENIX da mahalliy panjara qidiruvi va ikkilamchi struktura cheklovlari bilan global minimallashtirish yordamida real fazoda takomillashtirildi. Modelni takomillashtirish va strukturaviy tahlil qilish uchun MolProbity serveri ishlatilgan va rasmlar PyMOL va UCSF Chimera X yordamida bajarilgan. 67,68,69 Diafragma tahlili HOLE serveri yordamida amalga oshirildi,70 va ketma-ketlikni saqlash xaritasi Consurf serveri yordamida amalga oshirildi.71
Statistik tahlil Igor Pro 6.2, Excel Office 365 va GraphPad Prism 7.0 yordamida amalga oshirildi. Barcha miqdoriy ma'lumotlar o'rtacha ± standart xato (SEM) sifatida taqdim etilgan. Ikki guruhni taqqoslash uchun Studentning t-testi (ikki dumli, juftlashtirilmagan) ishlatilgan. Bir nechta guruhlarni taqqoslash uchun bir tomonlama dispersiya tahlili (ANOVA) va undan keyin Dunnettning post-hoc testi qo'llanilgan. *P<0.05, **P<0.01 va ***PMa'lumotlar taqsimotiga qarab <0,001 statistik jihatdan ahamiyatli deb hisoblandi. Kd, Ki qiymatlari va ularning assimetrik 95% ishonch oraliqlari GraphPad Prism 10 yordamida hisoblab chiqildi.
Tadqiqot metodologiyasi haqida batafsil ma'lumot olish uchun ushbu maqolada keltirilgan Tabiat portfeli hisobotining qisqacha mazmuniga qarang.
Dastlabki model PDB 4JPZ va 1CFD ma'lumotlar bazalaridan olingan kalmodulin modellari yordamida qurilgan. Koordinatalar Protein Ma'lumotlar Bankiga (PDB) 9NVN (ligandsiz Nan-Iav-CaM), 9NVO (nikotinamidga bog'langan Nan-Iav-CaM), 9NVP (nikotinamid va EDTAga bog'langan Nan-Iav-CaM), 9NVQ (afenidolpirrollin va kaltsiyga bog'langan Nan-Iav-CaM), 9NVR (afenidolpirrollin va EDTAga bog'langan Nan-Iav-CaM) va 9NVS (afenidolpirrollinga bog'langan Nan pentamer) raqamlari ostida saqlangan. Tegishli krio-elektron mikroskopiya tasvirlari Elektron Mikroskopiya Ma'lumotlar Bazasiga (EMDB) quyidagi kirish raqamlari ostida joylashtirilgan: EMD-49844 (ligandsiz Nan-Iav-CaM), EMD-49845 (nikotinamidli Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49846 (nikotinamid va EDTA bilan Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49847 (afidopirolin va kaltsiy bilan Nan-Iav-CaM kompleksi), EMD-49848 (afidopirolin va EDTA bilan Nan-Iav-CaM kompleksi) va EMD-49849 (afidopirolinli Nan pentamer kompleksi). Funktsional tahlil uchun xom ma'lumotlar ushbu maqolada keltirilgan.
Joylashtirilgan vaqt: 2026-yil 28-yanvar