Antelmintik preparat N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE (asetilxolinesteraza) ni inhibe qilishi va haddan tashqari vaskulyarizatsiya tufayli potentsial kanserogen xususiyatlarga ega ekanligi haqida xabar berilgan. Ushbu maqolada biz DEET maxsus angiogenezni rag'batlantiradigan endotelial hujayralarni rag'batlantirishini va shu bilan o'simta o'sishini oshirishini ko'rsatamiz. DEET angiogenezga olib keladigan hujayra jarayonlarini faollashtiradi, shu jumladan proliferatsiya, migratsiya va yopishqoqlik. Bu endotelial hujayralardagi NO ishlab chiqarishning ko'payishi va VEGF ifodasi bilan bog'liq. M3 ni o'chirish yoki farmakologik M3 ingibitorlaridan foydalanish bu ta'sirlarning barchasini bekor qildi, bu DEET tomonidan qo'zg'atilgan angiogenez M3 ga sezgir ekanligini ko'rsatadi. M3 retseptorlarini haddan tashqari ifodalovchi endotelial va HEK hujayralarida kaltsiy signalizatsiyasini o'z ichiga olgan tajribalar, shuningdek, bog'lash va joylashtirish tadqiqotlari DEET M3 retseptorlarining allosterik modulyatori sifatida harakat qilishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, DEET AChE ni inhibe qiladi, shu bilan atsetilxolinning biologik mavjudligini va uning M3 retseptorlari bilan bog'lanishini oshiradi va allosterik tartibga solish orqali proangiogen ta'sirni kuchaytiradi.
Birlamchi EK lar Shveytsariya sichqonlarining aortasidan ajratilgan. Ekstraksiya usuli Kobayashi protokoli 26 dan moslashtirilgan. Murin EClari to'rtinchi o'tishgacha 5% issiqlik bilan inaktivlangan FBS bilan to'ldirilgan EBM-2 muhitida o'stirildi.
Ikki DEET konsentratsiyasining HUVEC, U87MG yoki BF16F10 proliferatsiyasiga ta'siri CyQUANT hujayra proliferatsiyasini tahlil qilish to'plami (Molekulyar problar, C7026) yordamida tahlil qilindi. Qisqacha aytganda, har bir quduqqa 5,103 hujayra 96-quduqli plastinkaga ekilgan, bir kechada biriktirilishiga ruxsat berilgan va keyin 24 soat davomida DEET bilan ishlov berilgan. O'sish muhitini olib tashlaganingizdan so'ng, mikroplastinkaning har bir qudug'iga bo'yoq bilan bog'lovchi eritma qo'shing va hujayralarni 37 ° C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Floresan darajalari 485 nm qo'zg'atuvchi filtrlar va 530 nm emissiya filtrlari bilan jihozlangan Mithras LB940 multimode mikroplata o'quvchi (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germaniya) yordamida aniqlandi.
HUVEC har bir quduqqa 104 hujayra zichligida 96 quduqli plitalarga ekilgan. Hujayralar 24 soat davomida DEET bilan ishlov berildi. Hujayra hayotiyligi kolorimetrik MTT tahlili (Sigma-Aldrich, M5655) yordamida baholandi. Optik zichlik qiymatlari to'lqin uzunligi 570 nm bo'lgan multimodli mikroplata o'quvchida (Mithras LB940) olingan.
DEET ta'siri in vitro angiogenez tahlillari yordamida o'rganildi. 10-8 M yoki 10-5 M DEET bilan davolash HUVEClarda kapillyar uzunlik shakllanishini oshirdi (1a, b-rasm, oq chiziqlar). Nazorat guruhi bilan solishtirganda, 10-14 dan 10-5 M gacha bo'lgan DEET konsentratsiyasi bilan davolash kapillyar uzunligi 10-8 M DEET da platoga yetganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm S2). 10-8 M va 10-5 M konsentratsiya oralig'ida DEET bilan davolash qilingan HUVEClarning in vitro proangiogen ta'sirida sezilarli farq topilmadi.
DEETning neovaskulyarizatsiyaga ta'sirini aniqlash uchun biz in vivo neovaskulyarizatsiya tadqiqotlarini o'tkazdik. 14 kundan so'ng, 10-8 M yoki 10-5 M DEET bilan oldindan kultura qilingan endotelial hujayralar bilan AOK qilingan sichqonlar gemoglobin tarkibida sezilarli o'sishni ko'rsatdi (1c-rasm, oq chiziqlar).
Bundan tashqari, DEET bilan induktsiya qilingan neovaskulyarizatsiya U87MG ksenograftli sichqonlarda o'rganildi, ular har kuni (ip) DEET bilan ma'lum bo'lgan 10-5 M plazma kontsentratsiyasini keltirib chiqaradigan dozada yuborildi, bu ta'sirlangan odamlarda normaldir. da 23. Aniqlanadigan o'smalar (ya'ni >100 mm3 o'smalar) sichqonlarga U87MG hujayralari kiritilgandan 14 kun o'tgach kuzatilgan. 28-kuni DEET bilan davolash qilingan sichqonlarda o'simta o'sishi nazorat sichqonlari bilan solishtirganda sezilarli darajada oshdi (1d-rasm, kvadratlar). Bundan tashqari, o'smalarning CD31 bo'yalishi DEET kapillyar maydonini sezilarli darajada oshirganini, ammo mikrotomirlarning zichligini emasligini ko'rsatdi. (1e-g-rasm).
DETA tomonidan induktsiyalangan proliferatsiyada muskarinik retseptorlarning rolini aniqlash uchun pFHHSiD (10-7 M, selektiv M3 retseptorlari antagonisti) ishtirokida 10-8 M yoki 10-5 M DETA ishlatilgan. HUVECni davolash. pFHHSiD barcha kontsentratsiyalarda DETA ning proliferativ xususiyatlarini to'liq blokirovka qildi (1-jadval).
Bunday sharoitda biz DEET HUVEC hujayralarida kapillyar uzunligini oshiradimi yoki yo'qligini ham tekshirdik. Xuddi shunday, pFHHSiD DEET tomonidan qo'zg'atilgan kapillyar uzunligini sezilarli darajada oldini oldi (1a-rasm, b, kulrang chiziqlar). Bundan tashqari, shunga o'xshash tajribalar M3 siRNK bilan o'tkazildi. Nazorat qiluvchi siRNK kapillyar shakllanishini rag'batlantirishda samarali bo'lmasa-da, M3 muskarinik retseptorini o'chirish DEETning kapillyar uzunligini oshirish qobiliyatini bekor qildi (1a, b, qora chiziqlar).
Bundan tashqari, in vitro 10-8 M yoki 10-5 M DEET sabab bo'lgan vaskulyarizatsiya va in vivo neovaskulyarizatsiya pFHHSiD tomonidan to'liq bloklangan (1c-rasm, d, doiralar). Ushbu natijalar DEET selektiv M3 retseptorlari antagonistlariga yoki M3 siRNKga sezgir bo'lgan yo'l orqali angiogenezga yordam berishini ko'rsatadi.
AChE DEET ning molekulyar maqsadidir. Donepezil kabi AChE ingibitorlari sifatida ishlaydigan dorilar in vitro va sichqonchaning orqa oyoq ishemiyasi modellarida EK angiogenezini rag'batlantirishi mumkin14. Biz HUVECda DEET ning ikkita konsentratsiyasining AChE fermenti faolligiga ta'sirini sinab ko'rdik. DEET ning past (10-8 M) va yuqori (10-5 M) kontsentratsiyasi nazorat shartlariga nisbatan endotelial AChE faolligini pasaytirdi (2-rasm).
DEET ning ikkala kontsentratsiyasi (10-8 M va 10-5 M) HUVECda asetilkolinesteraza faolligini pasaytirdi. BW284c51 (10-5 M) asetilkolinesteraza inhibitörleri uchun nazorat sifatida ishlatilgan. Natijalar HUVEC dagi AChE faolligining DEET ning ikki kontsentratsiyasi bilan ishlov berilgan xujayralarga nisbatan ulushi sifatida ifodalanadi. Qiymatlar oltita mustaqil tajribaning o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. * p < 0,05 nazorat bilan solishtirganda (Kruskal-Wallis va Dunn ko'p taqqoslash testi).
Azot oksidi (NO) angiogen jarayonda 33 ishtirok etadi, shuning uchun DEET-stimulyatsiya qilingan HUVEClarda NO ishlab chiqarish o'rganildi. DEET bilan davolash qilingan endotelial NO ishlab chiqarish nazorat hujayralari bilan solishtirganda ko'paydi, lekin faqat 10-8 M dozada ahamiyatlilikka erishdi (3c-rasm). DEET tomonidan qo'zg'atilgan NO ishlab chiqarishni nazorat qiluvchi molekulyar o'zgarishlarni aniqlash uchun eNOS ifodasi va faollashuvi Western bloting orqali tahlil qilindi. DEET davolash eNOS ifodasini o'zgartirmagan bo'lsa-da, eNOS fosforilatsiyasida davolanmagan hujayralar bilan solishtirganda, uning faollashtiruvchi joyida (Ser-1177) eNOS fosforillanishini sezilarli darajada oshirdi va uning inhibitiv joyini (Thr-495) kamaytirdi (3d-rasm). Bundan tashqari, fosforlangan eNOS miqdorini fermentning umumiy miqdoriga normallashtirgandan so'ng, faollashtirish joyi va inhibitiv joydagi fosforlangan eNOS nisbati hisoblab chiqilgan. Bu nisbat har bir DEET konsentratsiyasi bilan ishlov berilgan HUVEClarda ishlov berilmagan hujayralarga nisbatan sezilarli darajada oshdi (3d-rasm).
Nihoyat, asosiy proangiogen omillardan biri bo'lgan VEGF ning ifodasi Western bloting tomonidan tahlil qilindi. DEET VEGF ifodasini sezilarli darajada oshirdi, pFHHSiD esa bu ifodani butunlay blokladi.
DEET ning ta'siri farmakologik blokadaga ham, M3 retseptorlarining pastga regulyatsiyasiga ham sezgir bo'lganligi sababli, biz DEET kaltsiy signalini kuchaytirishi mumkinligi haqidagi farazni sinab ko'rdik. Ajablanarlisi shundaki, DEET HUVEC (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va HEK/M3 (rasm 4a, b) sitoplazmatik kaltsiyni har ikkala ishlatilgan konsentratsiyalar uchun ham oshira olmadi.
Yuborilgan vaqt: 2024 yil 30-dekabr