Gelmintlarga qarshi preparat N,N-dietil-m-toluamid (DEET) AChE (atsetilxolinesteraza) ni inhibe qilishi va haddan tashqari qon tomirlanishi tufayli potentsial kanserogen xususiyatlarga ega ekanligi haqida xabar berilgan. Ushbu maqolada biz DEET angiogenezni rag'batlantiradigan endotelial hujayralarni rag'batlantirishini va shu bilan o'sma o'sishini kuchaytirishini ko'rsatamiz. DEET angiogenezga olib keladigan hujayra jarayonlarini, jumladan, proliferatsiya, migratsiya va adgeziyani faollashtiradi. Bu endotelial hujayralarda NO ishlab chiqarish va VEGF ekspressiyasining ortishi bilan bog'liq. M3 ni susaytirishi yoki farmakologik M3 ingibitorlaridan foydalanish bu ta'sirlarning barchasini yo'q qiladi, bu DEET tomonidan qo'zg'atilgan angiogenez M3 ga sezgir ekanligini ko'rsatadi. M3 retseptorlarini haddan tashqari ifodalovchi endotelial va HEK hujayralarida kaltsiy signalizatsiyasini o'z ichiga olgan tajribalar, shuningdek, bog'lash va doklash tadqiqotlari DEET M3 retseptorlarining allosterik modulyatori sifatida harakat qilishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, DEET AChE ni inhibe qiladi, shu bilan asetilxolinning biomavjudligini va uning M3 retseptorlariga bog'lanishini oshiradi va allosterik regulyatsiya orqali proangiogen ta'sirlarni kuchaytiradi.
Birlamchi EKlar Shveytsariya sichqonlarining aortasidan ajratildi. Ekstraksiya usuli Kobayashi protokolidan 26 moslashtirildi. Sichqoncha EKlari to'rtinchi o'tishgacha 5% issiqlik bilan inaktivatsiyalangan FBS bilan to'ldirilgan EBM-2 muhitida o'stirildi.
Ikki konsentratsiyali DEETning HUVEC, U87MG yoki BF16F10 ning ko'payishiga ta'siri CyQUANT hujayra ko'payishini tahlil qilish to'plami (Molecular Probes, C7026) yordamida tahlil qilindi. Qisqacha aytganda, har bir quduqqa 5,103 ta hujayra 96 quduqli plastinkaga ekildi, bir kechada yopishtirildi va keyin 24 soat davomida DEET bilan ishlov berildi. O'sish muhitini olib tashlaganingizdan so'ng, mikroplastinkaning har bir qudug'iga bo'yoq bog'lash eritmasini qo'shing va hujayralarni 37 °C da 30 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. Floresan darajalari 485 nm qo'zg'alish filtrlari va 530 nm emissiya filtrlari bilan jihozlangan Mithras LB940 ko'p rejimli mikroplastinka o'quvchi (Berthold Technologies, Bad Wildbad, Germaniya) yordamida aniqlandi.
HUVEC 96 quduqli plastinkalarga har bir quduqda 104 ta hujayra zichligida ekildi. Hujayralar 24 soat davomida DEET bilan ishlov berildi. Hujayralarning hayotiyligi kolorimetrik MTT tahlili (Sigma-Aldrich, M5655) yordamida baholandi. Optik zichlik qiymatlari 570 nm to'lqin uzunligida ko'p rejimli mikroplastinka o'quvchisida (Mithras LB940) olindi.
DEET ta'siri in vitro angiogenez tahlillari yordamida o'rganildi. 10-8 M yoki 10-5 M DEET bilan davolash HUVEClarda kapillyar uzunligining shakllanishini oshirdi (1a, b-rasm, oq chiziqlar). Nazorat guruhi bilan taqqoslaganda, 10-14 dan 10-5 M gacha bo'lgan DEET konsentratsiyalari bilan davolash kapillyar uzunligi 10-8 M DEET da platoga yetganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha S2-rasm). 10-8 M va 10-5 M konsentratsiya oralig'ida DEET bilan davolash qilingan HUVEClarning in vitro proangiogen ta'sirida sezilarli farq topilmadi.
DEET ning neovaskulyarizatsiyaga ta'sirini aniqlash uchun biz in vivo neovaskulyarizatsiya tadqiqotlarini o'tkazdik. 14 kundan so'ng, 10-8 M yoki 10-5 M DEET bilan oldindan kulturalangan endotelial hujayralar yuborilgan sichqonlarda gemoglobin miqdori sezilarli darajada oshdi (1c-rasm, oq chiziqlar).
Bundan tashqari, DEET tomonidan qo'zg'atilgan neovaskulyarizatsiya U87MG ksenograft tashuvchi sichqonlarda o'rganildi, ularga har kuni (ip) DEET plazma konsentratsiyasini 10-5 M ga oshirishi ma'lum bo'lgan dozada yuborildi, bu esa ta'sirlangan odamlarda normal holat. 23-da. Aniqlanadigan o'smalar (ya'ni >100 mm3 o'smalar) sichqonlarga U87MG hujayralari yuborilgandan 14 kun o'tgach kuzatildi. 28-kuni, DEET bilan davolangan sichqonlarda nazorat sichqonlariga nisbatan o'sma o'sishi sezilarli darajada oshdi (1d-rasm, kvadratlar). Bundan tashqari, o'smalarning CD31 bo'yalishi shuni ko'rsatdiki, DEET kapillyar maydonini sezilarli darajada oshirdi, ammo mikrotomirlar zichligini oshirmadi. (1e-g-rasm).
Muskarin retseptorlarining DETA tomonidan qo'zg'atilgan proliferatsiyadagi rolini aniqlash uchun pFHHSiD (10-7 M, selektiv M3 retseptor antagonisti) ishtirokida 10-8 M yoki 10-5 M DETA qo'llanildi. HUVEC bilan davolash. pFHHSiD barcha konsentratsiyalarda DETA ning proliferativ xususiyatlarini butunlay blokladi (1-jadval).
Ushbu sharoitlarda biz DEET HUVEC hujayralarida kapillyar uzunligini oshirishi yoki oshirmasligini ham tekshirdik. Xuddi shunday, pFHHSiD DEET tomonidan qo'zg'atilgan kapillyar uzunligini sezilarli darajada oldini oldi (1a, b-rasm, kulrang chiziqlar). Bundan tashqari, shunga o'xshash tajribalar M3 siRNA bilan o'tkazildi. Nazorat siRNAsi kapillyar shakllanishini rag'batlantirishda samarali bo'lmasa-da, M3 muskarin retseptorini susaytirishi DEETning kapillyar uzunligini oshirish qobiliyatini yo'q qildi (1a, b-rasm, qora chiziqlar).
Bundan tashqari, 10-8 M yoki 10-5 M DEET tomonidan in vitro qon tomirlanishi va in vivo neovaskulyarizatsiya pFHHSiD tomonidan to'liq bloklandi (1c-rasm, d, doiralar). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, DEET selektiv M3 retseptorlari antagonistlariga yoki M3 siRNAga sezgir yo'l orqali angiogenezni rag'batlantiradi.
AChE DEET ning molekulyar nishonidir. AChE ingibitorlari vazifasini bajaradigan donepezil kabi dorilar in vitro va sichqonchaning orqa oyoq-qo'l ishemiyasi modellarida EC angiogenezini rag'batlantirishi mumkin14. Biz HUVEC da DEET ning ikkita konsentratsiyasining AChE ferment faolligiga ta'sirini sinab ko'rdik. DEET ning past (10-8 M) va yuqori (10-5 M) konsentratsiyalari nazorat sharoitlariga nisbatan endotelial AChE faolligini pasaytirdi (2-rasm).
DEET ning ikkala konsentratsiyasi (10-8 M va 10-5 M) HUVEC da asetilxolinesteraza faolligini pasaytirdi. BW284c51 (10-5 M) asetilxolinesteraza ingibitorlari uchun nazorat sifatida ishlatilgan. Natijalar HUVEC da DEET ning ikki konsentratsiyasi bilan ishlov berilgan AChE faolligining vosita bilan ishlov berilgan hujayralarga nisbatan foiz sifatida ifodalanadi. Qiymatlar oltita mustaqil tajribaning o'rtacha ± SEM sifatida ifodalanadi. *p < 0,05 nazorat bilan solishtirganda (Kruskal-Uollis va Dann ko'p taqqoslash testi).
Azot oksidi (NO) angiogenik jarayon 33 da ishtirok etadi, shuning uchun DEET bilan stimulyatsiya qilingan HUVEClarda NO ishlab chiqarilishi o'rganildi. DEET bilan ishlov berilgan endotelial NO ishlab chiqarilishi nazorat hujayralariga nisbatan oshirildi, ammo ahamiyati faqat 10-8 M dozada yetdi (3c-rasm). DEET bilan qo'zg'atilgan NO ishlab chiqarishni boshqaruvchi molekulyar o'zgarishlarni aniqlash uchun eNOS ekspressiyasi va faollashuvi Western blotting yordamida tahlil qilindi. DEET bilan ishlov berish eNOS ekspressiyasini o'zgartirmagan bo'lsa-da, u eNOS fosforillanishidagi davolanmagan hujayralarga nisbatan faollashtiruvchi joyida (Ser-1177) eNOS fosforillanishini sezilarli darajada oshirdi va inhibitiv joyini (Thr-495) kamaytirdi (3d-rasm). Bundan tashqari, faollashtirish joyida va inhibitiv joyida fosforillangan eNOSning nisbati fosforillangan eNOS miqdorini fermentning umumiy miqdoriga normallashtirgandan so'ng hisoblab chiqildi. Bu nisbat davolanmagan hujayralarga nisbatan DEETning har bir konsentratsiyasi bilan ishlov berilgan HUVEClarda sezilarli darajada oshdi (3d-rasm).
Nihoyat, asosiy proangiogen omillardan biri bo'lgan VEGF ekspressiyasi Western blotting yordamida tahlil qilindi. DEET VEGF ekspressiyasini sezilarli darajada oshirdi, pFHHSiD esa bu ekspressiyani butunlay blokladi.
DEET ta'siri ham farmakologik blokadaga, ham M3 retseptorlarining pasayishiga sezgir bo'lgani uchun, biz DEET kaltsiy signalizatsiyasini kuchaytirishi mumkin degan gipotezani sinab ko'rdik. Ajablanarlisi shundaki, DEET ikkala ishlatilgan konsentratsiya uchun ham HUVEC (ma'lumotlar ko'rsatilmagan) va HEK/M3 (4a, b-rasm) da sitoplazmatik kaltsiyni oshira olmadi.
Nashr vaqti: 2024-yil 30-dekabr