Ushbu tadqiqotda, birgalikda davolashning rag'batlantiruvchi ta'sirio'simliklarning o'sish regulyatorlari(2,4-D va kinetin) va temir oksidi nanopartikullari (Fe₃O₄-NPs) *Hypericum perforatum* L. da in vitro morfogenez va ikkilamchi metabolit ishlab chiqarish bo'yicha o'rganildi. Optimallashtirilgan davolash [2,4-D (0,5 mg/L) + kinetin (2 mg/L) + Fe₃O₄-NPs (4 mg/L)] o'simlikning o'sish parametrlarini sezilarli darajada yaxshiladi: nazorat guruhiga nisbatan o'simlik balandligi 59,6% ga, ildiz uzunligi 114,0% ga, kurtak soni 180,0% ga va kallusning yangi og'irligi 198,3% ga oshdi. Ushbu kombinatsiyalangan davolash shuningdek, regeneratsiya samaradorligini (50,85%) oshirdi va giperitsin miqdorini 66,6% ga oshirdi. GC-MS tahlili giperosid, β-patolin va setil spirtining yuqori miqdorini aniqladi, bu umumiy cho'qqi maydonining 93,36% ni tashkil qiladi, fenoliklar va flavonoidlarning umumiy miqdori esa 80,1% gacha oshdi. Bu natijalar o'simliklarning o'sish regulyatorlari (PGR) va Fe₃O₄ nanopartikullari (Fe₃O₄-NPs) organogenez va bioaktiv birikmalarning to'planishini rag'batlantirish orqali sinergik ta'sir ko'rsatishini ko'rsatadi, bu esa dorivor o'simliklarni biotexnologik jihatdan takomillashtirishning istiqbolli strategiyasini ifodalaydi.
Avliyo Ioann worti (Hypericum perforatum L.), shuningdek, Avliyo Ioann worti nomi bilan ham tanilgan, Hypericaceae oilasiga mansub ko'p yillik o't o'simligi bo'lib, iqtisodiy ahamiyatga ega.[1] Uning potentsial bioaktiv komponentlari tabiiy taninlar, ksantonlar, floroglucinol, naftalinediantron (giperin va psevdogiperin), flavonoidlar, fenolik kislotalar va efir moylarini o'z ichiga oladi.[2,3,4] Avliyo Ioann worti an'anaviy usullar bilan ko'paytirilishi mumkin; ammo, an'anaviy usullarning mavsumiyligi, urug'larning past unib chiqishi va kasalliklarga moyilligi uning keng ko'lamda yetishtirish va ikkilamchi metabolitlarning uzluksiz shakllanishi potentsialini cheklaydi.[1,5,6]
Shunday qilib, in vitro to'qima madaniyati o'simliklarni tez ko'paytirish, gerplazma resurslarini saqlash va dorivor birikmalar hosildorligini oshirish uchun samarali usul hisoblanadi [7, 8]. O'simliklarning o'sish regulyatorlari (PGR) morfogenezni tartibga solishda muhim rol o'ynaydi va kallus va butun organizmlarni in vitro yetishtirish uchun zarurdir. Ularning konsentratsiyasi va kombinatsiyalarini optimallashtirish ushbu rivojlanish jarayonlarini muvaffaqiyatli yakunlash uchun juda muhimdir [9]. Shuning uchun, regulyatorlarning tegishli tarkibi va konsentratsiyasini tushunish Avliyo Ioann wortining (H. perforatum) o'sishi va regenerativ qobiliyatini yaxshilash uchun muhimdir [10].
Temir oksidi nanopartikullari (Fe₃O₄) to'qima kulturasi uchun ishlab chiqilgan yoki ishlab chiqilayotgan nanopartikullar sinfidir. Fe₃O₄ sezilarli magnit xususiyatlarga, yaxshi biomoslikka va o'simliklarning o'sishini rag'batlantirish va atrof-muhitdagi stressni kamaytirish qobiliyatiga ega, shuning uchun u to'qima kulturasi dizaynlarida katta e'tiborni tortdi. Ushbu nanopartikullarning potentsial qo'llanilishi hujayra bo'linishini rag'batlantirish, ozuqa moddalarining so'rilishini yaxshilash va antioksidant fermentlarni faollashtirish uchun in vitro kulturasini optimallashtirishni o'z ichiga olishi mumkin [11].
Nanopartikullar o'simliklarning o'sishiga yaxshi ta'sir ko'rsatgan bo'lsa-da, Fe₃O₄ nanopartikullari va *H. perforatum* da optimallashtirilgan o'simlik o'sishi regulyatorlarini birgalikda qo'llash bo'yicha tadqiqotlar kamligicha qolmoqda. Ushbu bilim bo'shlig'ini to'ldirish uchun ushbu tadqiqot dorivor o'simliklarning xususiyatlarini yaxshilash uchun yangi tushunchalar berish maqsadida ularning in vitro morfogenezi va ikkilamchi metabolitlar ishlab chiqarishga birgalikdagi ta'sirini baholadi. Shuning uchun ushbu tadqiqotning ikkita maqsadi bor: (1) kallus hosil bo'lishini, kurtaklar regeneratsiyasini va ildiz otishini in vitro samarali rag'batlantirish uchun o'simliklarning o'sishi regulyatorlarining konsentratsiyasini optimallashtirish; va (2) Fe₃O₄ nanopartikullarining in vitro o'sish parametrlariga ta'sirini baholash. Kelajakdagi rejalar orasida iqlimlashtirish (in vitro) paytida qayta tiklangan o'simliklarning omon qolish darajasini baholash kiradi. Ushbu tadqiqot natijalari *H. perforatum* ning mikroko'payish samaradorligini sezilarli darajada yaxshilaydi va shu bilan ushbu muhim dorivor o'simlikdan barqaror foydalanish va biotexnologik qo'llanilishiga hissa qo'shadi, deb kutilmoqda.
Ushbu tadqiqotda biz dala sharoitida yetishtirilgan bir yillik Avliyo Ioann wort o'simliklaridan (ona o'simliklari) barg ekstraplantlarini oldik. Bu ekstraplantlar in vitro sharoitida yetishtirish sharoitlarini optimallashtirish uchun ishlatilgan. Kultivatsiya qilishdan oldin, barglar bir necha daqiqa davomida oqayotgan distillangan suv ostida yaxshilab chayqaldi. Keyin ekstraplant yuzalari 70% etanolga 30 soniya davomida botirish orqali dezinfektsiya qilindi, so'ngra bir necha tomchi Tween 20 ni o'z ichiga olgan 1,5% natriy gipoxlorit (NaOCl) eritmasiga 10 daqiqa davomida botirildi. Nihoyat, ekstraplantlar keyingi kultivatsiya muhitiga o'tkazishdan oldin uch marta steril distillangan suv bilan chayqaldi.
Keyingi to'rt hafta davomida novdalarning regeneratsiya parametrlari, jumladan, regeneratsiya tezligi, har bir eksplantdagi novdalar soni va novda uzunligi o'lchandi. Regeneratsiya qilingan novdalar kamida 2 sm uzunlikka yetganda, ular yarim kuchli MS muhiti, 0,5 mg/L indolbutirik kislota (IBA) va 0,3% guar saqichidan iborat ildiz otish muhitiga o'tkazildi. Ildiz otish kulturasi uch hafta davom etdi, shu vaqt ichida ildiz otish tezligi, ildiz soni va ildiz uzunligi o'lchandi. Har bir ishlov berish uch marta takrorlandi, har bir takrorlashda 10 ta eksplant o'stirildi, natijada har bir ishlov berishda taxminan 30 ta eklant hosil bo'ldi.
O'simlikning balandligi o'simlikning tagidan eng baland bargning uchigacha bo'lgan o'lchov vositasi yordamida santimetrda (sm) o'lchandi. Ildiz uzunligi ko'chatlarni ehtiyotkorlik bilan olib tashlash va o'stirish muhitini olib tashlashdan so'ng darhol millimetrda (mm) o'lchandi. Har bir o'simlikda har bir eksplantatsiyadagi kurtaklar soni to'g'ridan-to'g'ri hisoblandi. Barglardagi qora dog'lar, ya'ni tugunlar soni vizual ravishda o'lchandi. Bu qora tugunlar giperitsin yoki oksidlovchi dog'larni o'z ichiga olgan bezlar deb hisoblanadi va o'simlikning davolanishga javobining fiziologik ko'rsatkichi sifatida ishlatiladi. Barcha o'stirish muhitini olib tashlagandan so'ng, ko'chatlarning yangi og'irligi milligramm (mg) aniqlikdagi elektron tarozi yordamida o'lchandi.
Kallus hosil bo'lish tezligini hisoblash usuli quyidagicha: to'rt hafta davomida turli o'sish regulyatorlari (kinazalar, 2,4-D va Fe3O4) bo'lgan muhitda eksplantlarni yetishtirgandan so'ng, kallus hosil qila oladigan eksplantlar soni hisoblanadi. Kallus hosil bo'lish tezligini hisoblash formulasi quyidagicha:
Har bir davolash uch marta takrorlandi, har bir takrorlashda kamida 10 ta eksplant tekshirildi.
Regeneratsiya darajasi kallus shakllanish bosqichidan keyin kurtak differentsiatsiyasi jarayonini muvaffaqiyatli yakunlagan kallus to'qimasining ulushini aks ettiradi. Bu ko'rsatkich kallus to'qimasining differentsiatsiyalangan to'qimaga aylanish va yangi o'simlik organlariga o'sish qobiliyatini ko'rsatadi.
Ildizlanish koeffitsienti - bu ildiz otishga qodir shoxlar sonining umumiy shoxlar soniga nisbati. Bu ko'rsatkich ildiz otish bosqichining muvaffaqiyatini aks ettiradi, bu mikroko'payish va o'simliklarni ko'paytirishda juda muhimdir, chunki yaxshi ildiz otish ko'chatlarning o'sish sharoitida yaxshiroq omon qolishiga yordam beradi.
Giperitsin birikmalari 90% metanol bilan ekstraksiya qilindi. 1 ml metanolga ellik mg quritilgan o'simlik moddasi qo'shildi va xona haroratida qorong'ida, 30 kHz chastotada ultratovush tozalagichda (A5120-3YJ modeli) 20 daqiqa davomida sonikatsiya qilindi. Sonicatsiyadan so'ng, namuna 15 daqiqa davomida 6000 rpm tezlikda santrifuga qilindi. Supernatant yig'ildi va giperitsinning yutilishi Conceiçao va boshqalar tomonidan tasvirlangan usulga muvofiq Plus-3000 S spektrofotometr yordamida 592 nm da o'lchandi [14].
O'simliklarning o'sish regulyatorlari (PGR) va temir oksidi nanopartikullari (Fe₃O₄-NPs) bilan davolashning aksariyati qayta tiklangan kurtak barglarida qora tugun hosil bo'lishiga olib kelmadi. 0,5 yoki 1 mg/L 2,4-D, 0,5 yoki 1 mg/L kinetin yoki 1, 2 yoki 4 mg/L temir oksidi nanopartikullari bilan davolashning birortasida ham tugunlar kuzatilmadi. Bir nechta kombinatsiyalar kinetin va/yoki temir oksidi nanopartikullarining yuqori konsentratsiyalarida tugun rivojlanishining biroz oshganligini ko'rsatdi (lekin statistik jihatdan ahamiyatli emas), masalan, 2,4-D (0,5-2 mg/L) ning kinetin (1-1,5 mg/L) va temir oksidi nanopartikullari (2-4 mg/L) bilan kombinatsiyasi. Bu natijalar 2-rasmda ko'rsatilgan. Qora tugunlar tabiiy ravishda uchraydigan va foydali bo'lgan giperitsinga boy bezlarni ifodalaydi. Ushbu tadqiqotda qora tugunlar asosan to'qimalarning jigarrang rangga kirishi bilan bog'liq bo'lib, bu giperitsin to'planishi uchun qulay muhitni ko'rsatadi. 2,4-D, kinetin va Fe₃O₄ nanopartikullari bilan ishlov berish kallus o'sishini, jigarrang rangning kamayishini va xlorofil miqdorining oshishini rag'batlantirdi, bu metabolik funktsiyaning yaxshilanishini va oksidlovchi shikastlanishning kamayishini ko'rsatadi [37]. Ushbu tadqiqotda kinetinning 2,4-D va Fe₃O₄ nanopartikullari bilan birgalikda Avliyo Ioann worti kallusining o'sishi va rivojlanishiga ta'siri baholandi (3a-g-rasm). Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Fe₃O₄ nanopartikullari antifungal va antimikrobial faollikka ega [38, 39] va o'simliklarning o'sish regulyatorlari bilan birgalikda ishlatilganda o'simliklarni himoya qilish mexanizmlarini rag'batlantirishi va hujayra stress indekslarini kamaytirishi mumkin [18]. Ikkilamchi metabolitlarning biosintezi genetik jihatdan tartibga solinsa-da, ularning haqiqiy hosildorligi atrof-muhit sharoitlariga juda bog'liq. Metabolik va morfologik o'zgarishlar ma'lum o'simlik genlarining ifodasini tartibga solish va atrof-muhit omillariga javob berish orqali ikkilamchi metabolit darajasiga ta'sir qilishi mumkin. Bundan tashqari, induktorlar yangi genlarning faollashishini qo'zg'atishi mumkin, bu esa o'z navbatida fermentativ faollikni rag'batlantiradi, natijada bir nechta biosintez yo'llarini faollashtiradi va ikkilamchi metabolitlarning hosil bo'lishiga olib keladi. Bundan tashqari, yana bir tadqiqot shuni ko'rsatdiki, soyani kamaytirish quyosh nuri ta'sirini oshiradi, shu bilan *Hypericum perforatum* ning tabiiy yashash joyida kunduzgi haroratni ko'taradi, bu esa giperitsin hosildorligini oshirishga ham hissa qo'shadi. Ushbu ma'lumotlarga asoslanib, ushbu tadqiqot temir nanopartikullarining to'qima madaniyatida potentsial induktor sifatidagi rolini o'rganib chiqdi. Natijalar shuni ko'rsatdiki, bu nanopartikullar fermentativ stimulyatsiya orqali hesperidin biosintezida ishtirok etadigan genlarni faollashtirishi mumkin, bu esa ushbu birikmaning to'planishini oshiradi (2-rasm). Shuning uchun, tabiiy sharoitlarda o'sadigan o'simliklar bilan solishtirganda, bunday birikmalarning in vivo ishlab chiqarilishi o'rtacha stress ikkilamchi metabolitlarning biosintezida ishtirok etadigan genlarning faollashishi bilan birlashtirilganda ham kuchayishi mumkin, deb ta'kidlash mumkin. Kombinatsiyalangan davolash odatda regeneratsiya tezligiga ijobiy ta'sir ko'rsatadi, ammo ba'zi hollarda bu ta'sir zaiflashadi. Shunisi e'tiborga loyiqki, 1 mg/L 2,4-D, 1,5 mg/L kinaza va turli konsentratsiyalar bilan davolash nazorat guruhiga nisbatan regeneratsiya tezligini mustaqil ravishda va sezilarli darajada 50,85% ga oshirishi mumkin (4c-rasm). Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, nanogormonlarning o'ziga xos kombinatsiyalari o'simliklarning o'sishi va metabolitlar ishlab chiqarishni rag'batlantirish uchun sinergik ta'sir ko'rsatishi mumkin, bu esa dorivor o'simliklarning to'qima madaniyati uchun katta ahamiyatga ega. Palmer va Keller [50] 2,4-D bilan davolash St. perforatumda kallus hosil bo'lishini mustaqil ravishda keltirib chiqarishi mumkinligini, kinaza qo'shilishi esa kallus hosil bo'lishi va regeneratsiyasini sezilarli darajada kuchaytirganini ko'rsatdilar. Bu ta'sir gormonal muvozanatning yaxshilanishi va hujayra bo'linishini rag'batlantirish bilan bog'liq edi. Bal va boshqalar [51] Fe₃O₄-NP bilan davolash antioksidant fermentlarning funktsiyasini mustaqil ravishda kuchaytirishi va shu bilan St. perforatumda ildiz o'sishini rag'batlantirishi mumkinligini aniqladilar. 0,5 mg/L, 1 mg/L va 1,5 mg/L konsentratsiyalarda Fe₃O₄ nanopartikullarini o'z ichiga olgan kultivatsiya muhiti zig'ir o'simliklarining regeneratsiya tezligini oshirdi [52]. Kinetin, 2,4-dixlorbenzotiazolinon va Fe₃O₄ nanopartikullaridan foydalanish kallus va ildiz hosil bo'lish tezligini sezilarli darajada oshirdi, ammo in vitro regeneratsiya uchun bu gormonlardan foydalanishning potentsial yon ta'sirini hisobga olish kerak. Masalan, 2,4-dixlorbenzotiazolinon yoki kinetinni uzoq muddatli yoki yuqori konsentratsiyada qo'llash somatik klonal o'zgarishga, oksidlovchi stressga, g'ayritabiiy kallus morfologiyasiga yoki vitrifikatsiyaga olib kelishi mumkin. Shuning uchun, yuqori regeneratsiya darajasi genetik barqarorlikni oldindan aytib bermaydi. Barcha regeneratsiya qilingan o'simliklar ularning bir xilligi va in vivo o'simliklarga o'xshashligini aniqlash uchun molekulyar markerlar (masalan, RAPD, ISSR, AFLP) yoki sitogenetik tahlil yordamida baholanishi kerak [53,54,55].
Ushbu tadqiqot birinchi marta o'simliklarning o'sish regulyatorlarini (2,4-D va kinetin) Fe₃O₄ nanopartikullari bilan birgalikda qo'llash *Hypericum perforatum* da morfogenezni va asosiy bioaktiv metabolitlarning (shu jumladan giperitsin va giperozid) to'planishini kuchaytirishi mumkinligini ko'rsatdi. Optimallashtirilgan davolash rejimi (1 mg/L 2,4-D + 1 mg/L kinetin + 4 mg/L Fe₃O₄-NP) nafaqat kallus hosil bo'lishini, organogenezni va ikkilamchi metabolit hosildorligini maksimal darajada oshirdi, balki o'simlikning stressga chidamliligini va dorivor qiymatini oshirishi mumkin bo'lgan engil induktiv ta'sirni ham ko'rsatdi. Nanotexnologiya va o'simlik to'qimasi madaniyatining kombinatsiyasi dorivor birikmalarni keng ko'lamli in vitro ishlab chiqarish uchun barqaror va samarali platformani taqdim etadi. Bu natijalar sanoat qo'llanilishi va molekulyar mexanizmlar, dozani optimallashtirish va genetik aniqlik bo'yicha kelajakdagi tadqiqotlar uchun yo'l ochib beradi, shu bilan dorivor o'simliklar bo'yicha fundamental tadqiqotlarni amaliy biotexnologiya bilan bog'laydi.
Nashr vaqti: 2025-yil 12-dekabr