Apikal meristemaning (SAM) o'sishi poya arxitekturasi uchun juda muhimdir. O'simlik gormonlarigibberellinlar(GA) o'simliklarning o'sishini muvofiqlashtirishda muhim rol o'ynaydi, ammo ularning SAMdagi roli hali ham yaxshi tushunilmagan. Bu yerda biz DELLA oqsilini GA transkripsiyaviy javobidagi muhim tartibga solish funktsiyasini bostirish va GA ni aniqlashda uning degradatsiyasini saqlab qolish orqali GA signalizatsiyasining nisbatometrik biosensorini ishlab chiqdik. Biz ushbu degradatsiyaga asoslangan biosensor rivojlanish jarayonida GA darajasidagi o'zgarishlarni va hujayra sezgisini aniq qayd etishini ko'rsatamiz. Biz ushbu biosensordan SAMdagi GA signalizatsiya faolligini xaritalash uchun foydalandik. Biz yuqori GA signallari asosan organ primordiyalari orasida joylashgan hujayralarda mavjudligini ko'rsatamiz, ular tugunlararo hujayralarning prekursorlari hisoblanadi. Funktsiyani oshirish va yo'qotish yondashuvlaridan foydalanib, biz GA hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishini tartibga solishini, tugunlararo hujayralarning kanonik hujayrali tashkil etilishini o'rnatishini va shu bilan SAMda tugunlararo spetsifikatsiyani rag'batlantirishini yana bir bor ko'rsatamiz.
Kurtak uchida joylashgan kurtak apikal meristemasi (SAM) o'simlikning butun hayoti davomida modulli va iterativ tarzda lateral organlar va ildiz tugunlarini hosil qiluvchi ildiz hujayralari o'rnini o'z ichiga oladi. Ushbu takrorlanuvchi birliklarning har biri yoki o'simlik tugunlari tugunlardagi internodal va lateral organlarni hamda barg qo'ltiqlaridagi qo'ltiq osti meristemalarini o'z ichiga oladi1. O'simlik tugunlarining o'sishi va tashkil etilishi rivojlanish jarayonida o'zgaradi. Arabidopsisda vegetativ bosqichda internodal o'sish bostiriladi va qo'ltiq osti meristemalari rozet barglari qo'ltiqlarida uxlab qoladi. Gul fazasiga o'tish davrida SAM gullash meristemasiga aylanadi, cho'zilgan internodal va qo'ltiq osti kurtaklarini, gul barglari qo'ltiqlarida shoxchalarni va keyinchalik bargsiz gullarni hosil qiladi2. Barglar, gullar va shoxlarning paydo bo'lishini boshqaruvchi mexanizmlarni tushunishda sezilarli yutuqlarga erishgan bo'lsak-da, internodallarning qanday paydo bo'lishi haqida nisbatan kam ma'lumot mavjud.
GAlarning fazoviy-vaqtinchalik taqsimlanishini tushunish ushbu gormonlarning turli to'qimalarda va turli rivojlanish bosqichlarida funktsiyalarini yaxshiroq tushunishga yordam beradi. O'z promouteri ta'sirida ifodalangan RGA-GFP birikishining degradatsiyasini vizualizatsiya qilish ildizlardagi umumiy GA darajalarini tartibga solish bo'yicha muhim ma'lumotlarni beradi15,16. Biroq, RGA ifodasi to'qimalarda farq qiladi17 va GA18 tomonidan tartibga solinadi. Shunday qilib, RGA promouterining differentsial ifodasi RGA-GFP bilan kuzatiladigan fluoresensiya naqshiga olib kelishi mumkin va shuning uchun bu usul miqdoriy emas. Yaqinda bioaktiv fluoresenin (Fl) bilan belgilangan GA19,20 ildiz endokorteksida GA to'planishini va uning hujayra darajalarini GA transporti orqali tartibga solishini aniqladi. Yaqinda GA FRET sensori nlsGPS1 GA darajalari ildizlarda, filamentlarda va to'q o'sgan gipokotillarda21 hujayra uzayishi bilan bog'liqligini ko'rsatdi. Biroq, biz ko'rib turganimizdek, GA konsentratsiyasi GA signalizatsiya faolligini boshqaruvchi yagona parametr emas, chunki u murakkab sezish jarayonlariga bog'liq. Bu yerda, DELLA va GA signalizatsiya yo'llari haqidagi tushunchamizga asoslanib, biz GA signalizatsiyasi uchun degradatsiyaga asoslangan nisbatometrik biosensorni ishlab chiqish va tavsiflash haqida xabar beramiz. Ushbu miqdoriy biosensorni ishlab chiqish uchun biz lyuminestsent oqsilga birlashtirilgan va to'qimalarda hamma joyda ifodalangan mutant GA-sezgir RGA, shuningdek, GA-sezgir bo'lmagan lyuminestsent oqsildan foydalandik. Biz mutant RGA oqsil birikishlari hamma joyda ifodalanganda endogen GA signalizatsiyasiga xalaqit bermasligini va bu biosensor yuqori fazoviy-vaqtinchalik aniqlik bilan sezish apparati tomonidan GA kirishi va GA signalini qayta ishlash natijasida hosil bo'lgan signalizatsiya faolligini aniqlashi mumkinligini ko'rsatamiz. Biz ushbu biosensordan GA signalizatsiya faolligining fazoviy-vaqtinchalik taqsimotini xaritalash va GA SAM epidermisida hujayra xatti-harakatlarini qanday boshqarishini aniqlash uchun foydalandik. Biz GA organ primordiyalari orasida joylashgan SAM hujayralarining bo'linish tekisligining yo'nalishini tartibga solishini va shu bilan internodening kanonik hujayrali tuzilishini belgilashini ko'rsatamiz.
Nihoyat, biz qmRGA o'sayotgan gipokotillardan foydalangan holda endogen GA darajasidagi o'zgarishlarni xabar qila oladimi, deb so'radik. Biz ilgari nitrat GA sintezini va o'z navbatida DELLA34 degradatsiyasini oshirish orqali o'sishni rag'batlantirishini ko'rsatgan edik. Shunga ko'ra, biz mo'l-ko'l nitrat ta'minoti (10 mM NO3−) ostida o'stirilgan pUBQ10::qmRGA ko'chatlarida gipokotil uzunligi nitrat yetishmaydigan sharoitlarda o'stirilgan ko'chatlarga qaraganda ancha uzunroq ekanligini kuzatdik (Qo'shimcha 6a-rasm). O'sish reaksiyasiga muvofiq, GA signallari 10 mM NO3− sharoitida o'stirilgan ko'chatlarning gipokotillarida nitrat yo'qligida o'stirilgan ko'chatlarga qaraganda yuqoriroq edi (Qo'shimcha 6b-rasm, c). Shunday qilib, qmRGA shuningdek, GA konsentratsiyasidagi endogen o'zgarishlar natijasida kelib chiqqan GA signalizatsiyasidagi o'zgarishlarni kuzatish imkonini beradi.
qmRGA tomonidan aniqlangan GA signalizatsiya faolligi GA konsentratsiyasi va GA idrokiga bog'liqligini tushunish uchun, sensor dizayniga asoslanib kutilganidek, biz vegetativ va reproduktiv to'qimalarda uchta GID1 retseptorlarining ifodasini tahlil qildik. Ko'chatlarda GID1-GUS muxbiri liniyasi GID1a va c kotiledonlarda yuqori darajada ifodalanganligini ko'rsatdi (3a-c-rasm). Bundan tashqari, uchta retseptorning barchasi barglarda, lateral ildiz primordiyalarida, ildiz uchlarida (GID1b ning ildiz qopqog'idan tashqari) va qon tomir tizimida ifodalangan (3a-c-rasm). Gullash SAMida biz faqat GID1b va 1c uchun GUS signallarini aniqladik (7a-c-qo'shimcha rasm). In situ gibridizatsiya bu ifoda naqshlarini tasdiqladi va GID1c SAMda past darajalarda bir xil ifodalanganligini, GID1b esa SAMning chetida yuqori ifodalanganligini ko'rsatdi (7d-l-qo'shimcha rasm). pGID1b::2xmTQ2-GID1b translyatsion birikishi shuningdek, SAM markazida past yoki umuman ifodalanmaslikdan organ chegaralarida yuqori ifodalanishgacha bo'lgan GID1b ifodalanishining bosqichli diapazonini aniqladi (7m-qo'shimcha rasm). Shunday qilib, GID1 retseptorlari to'qimalar bo'ylab va ichida bir tekis taqsimlanmagan. Keyingi tajribalarda biz GID1 (pUBQ10::GID1a-mCherry) ning haddan tashqari ifodalanishi gipokotillarda qmRGA ning tashqi GA qo'llanilishiga sezgirligini oshirganini ham kuzatdik (3d-rasm, e). Aksincha, gipokotilda qd17mRGA bilan o'lchangan lyuminestsentsiya GA3 bilan davolashga sezgir emas edi (3f-rasm, g). Ikkala tahlil uchun ham sensorning tezkor xatti-harakatlarini baholash uchun ko'chatlar yuqori konsentratsiyali GA (100 μM GA3) bilan ishlov berildi, bu yerda GID1 retseptoriga bog'lanish qobiliyati kuchaygan yoki yo'qolgan. Birgalikda, bu natijalar qmRGA biosensorining GA va GA sensori sifatida birgalikdagi funktsiyani bajarishini tasdiqlaydi va GID1 retseptorining differentsial ifodasi sensorning emissiyasini sezilarli darajada modulyatsiya qilishi mumkinligini ko'rsatadi.
Bugungi kunga qadar SAMda GA signallarining tarqalishi noma'lumligicha qolmoqda. Shuning uchun biz qmRGA ifodalovchi o'simliklar va pCLV3::mCherry-NLS ildiz hujayralari muxbiridan35 foydalanib, GA signalizatsiya faolligining yuqori aniqlikdagi miqdoriy xaritalarini hisobladik, bunda L1 qatlamiga (epidermis; 4a, b-rasm, usullar va qo'shimcha usullarga qarang) e'tibor qaratdik, chunki L1 SAM o'sishini boshqarishda muhim rol o'ynaydi36. Bu yerda pCLV3::mCherry-NLS ifodasi GA signalizatsiya faolligining fazoviy-vaqtinchalik taqsimotini tahlil qilish uchun belgilangan geometrik mos yozuvlar nuqtasini taqdim etdi37. GA lateral organ rivojlanishi uchun muhim deb hisoblansa-da4, biz P3 bosqichidan boshlab gulli primordiumda (P) GA signallari past ekanligini kuzatdik (4a, b-rasm), yosh P1 va P2 primordiumlari esa markaziy mintaqadagiga o'xshash o'rtacha faollikka ega edi (4a, b-rasm). Yuqori GA signalizatsiya faolligi organ primordium chegaralarida, P1/P2 dan (chegara yon tomonlaridan) boshlanib, P4 da cho'qqiga chiqqan holda, shuningdek, primordiyalar orasida joylashgan periferik mintaqaning barcha hujayralarida aniqlandi (4a, b-rasm va 8a, b-qo'shimcha rasm). Bu yuqori GA signalizatsiya faolligi nafaqat epidermisda, balki L2 va yuqori L3 qatlamlarida ham kuzatildi (8b-qo'shimcha rasm). qmRGA yordamida SAMda aniqlangan GA signallarining shakli ham vaqt o'tishi bilan o'zgarishsiz qoldi (8c–f-rasm, k-qo'shimcha). Garchi qd17mRGA konstruktsiyasi biz batafsil tavsiflagan beshta mustaqil liniyadan T3 o'simliklarining SAM-ida tizimli ravishda pastga tushirilgan bo'lsa-da, biz pRPS5a::VENUS-2A-TagBFP konstruktsiyasi bilan olingan lyuminestsent naqshlarni tahlil qila oldik (8g–j-qo'shimcha rasm, l-rasm). Ushbu nazorat chizig'ida SAMda lyuminestsentsiya nisbatida faqat kichik o'zgarishlar aniqlandi, ammo SAM markazida biz TagBFP bilan bog'liq VENUSning aniq va kutilmagan pasayishini kuzatdik. Bu qmRGA tomonidan kuzatilgan signalizatsiya naqshining mRGA-VENUSning GA ga bog'liq degradatsiyasini aks ettirishini tasdiqlaydi, shuningdek, qmRGA meristema markazida GA signalizatsiya faolligini oshirib yuborishi mumkinligini ko'rsatadi. Xulosa qilib aytganda, bizning natijalarimiz asosan primordiyalarning tarqalishini aks ettiruvchi GA signalizatsiya naqshini ochib beradi. Primordiallararo mintaqaning (IPR) bu taqsimoti rivojlanayotgan primordium va markaziy mintaqa o'rtasida yuqori GA signalizatsiya faolligining asta-sekin o'rnatilishi bilan bog'liq, shu bilan birga primordiumda GA signalizatsiya faolligi pasayadi (4c, d-rasm).
GID1b va GID1c retseptorlarining taqsimlanishi (yuqoriga qarang) GA retseptorlarining differentsial ifodalanishi SAMda GA signalizatsiya faolligi naqshini shakllantirishga yordam berishini ko'rsatadi. Biz GA ning differentsial to'planishi ishtirok etishi mumkinmi, deb o'yladik. Ushbu imkoniyatni o'rganish uchun biz nlsGPS1 GA FRET sensoridan foydalandik21. 100 daqiqa davomida 10 μM GA4+7 bilan ishlov berilgan nlsGPS1 ning SAMida faollashuv chastotasining oshishi aniqlandi (9a-e qo'shimcha rasm), bu nlsGPS1 ning ildizlarda bo'lgani kabi SAMdagi GA konsentratsiyasining o'zgarishiga javob berishini ko'rsatadi21. nlsGPS1 faollashuv chastotasining fazoviy taqsimlanishi SAMning tashqi qatlamlarida nisbatan past GA darajalarini aniqladi, ammo ular markazda va SAM chegaralarida ko'tarilganligini ko'rsatdi (4e-rasm va 9a,c qo'shimcha rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, GA SAMda ham qmRGA tomonidan aniqlangan fazoviy naqshga o'xshash fazoviy naqsh bilan taqsimlangan. Qo'shimcha yondashuv sifatida biz SAMni lyuminestsent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) yoki faqat Fl bilan salbiy nazorat sifatida davoladik. Fl signali markaziy mintaqa va primordiumni o'z ichiga olgan holda SAM bo'ylab tarqaldi, ammo pastroq intensivlikda (4j-rasm va 10d-qo'shimcha rasm). Aksincha, uchta GA-Fl ham primordium chegaralarida va IPRning qolgan qismida turli darajalarda to'plandi, GA7-Fl esa IPRdagi eng katta domenda to'plandi (4k-rasm va 10a,b-qo'shimcha rasm). Floresan intensivligini miqdoriy aniqlash shuni ko'rsatdiki, GA-Fl bilan ishlov berilgan SAMda IPR ga IPR bo'lmagan intensivlik nisbati Fl bilan ishlov berilgan SAMga nisbatan yuqoriroq edi (4l-rasm va 10c-qo'shimcha rasm). Birgalikda, bu natijalar GA organ chegarasiga eng yaqin joylashgan IPR hujayralarida yuqori konsentratsiyalarda mavjudligini ko'rsatadi. Bu shuni ko'rsatadiki, SAM GA signalizatsiya faolligi naqshlari GA retseptorlarining differentsial ifodalanishi va organ chegaralari yaqinidagi IPR hujayralarida GA ning differentsial to'planishi natijasida yuzaga keladi. Shunday qilib, bizning tahlilimiz GA signalizatsiyasining kutilmagan fazoviy-vaqtinchalik naqshini aniqladi, bunda SAM markazi va primordiumida pastroq faollik va periferik mintaqada IPRda yuqori faollik kuzatildi.
SAMda differentsial GA signalizatsiya faolligining rolini tushunish uchun biz SAM qmRGA pCLV3::mCherry-NLS ning real vaqt rejimida tasvirlash yordamida GA signalizatsiya faolligi, hujayra kengayishi va hujayra bo'linishi o'rtasidagi korrelyatsiyani tahlil qildik. O'sishni tartibga solishda GA ning rolini hisobga olgan holda, hujayra kengayishi parametrlari bilan ijobiy korrelyatsiya kutilgan edi. Shuning uchun biz avval GA signalizatsiya faolligi xaritalarini hujayra yuzasi o'sish tezligi xaritalari (ma'lum bir hujayra uchun va bo'linishdagi qiz hujayralar uchun hujayra kengayishi kuchining proksi sifatida) va hujayra kengayishining yo'nalishini o'lchaydigan o'sish anizotropiyasi xaritalari bilan taqqosladik (bu yerda ma'lum bir hujayra uchun va bo'linishdagi qiz hujayralar uchun ham qo'llaniladi; 5a, b-rasm, Usullar va Qo'shimcha usullarga qarang). SAM hujayra yuzasi o'sish tezligi xaritalarimiz oldingi kuzatuvlarga mos keladi38,39, chegarada minimal o'sish sur'atlari va rivojlanayotgan gullarda maksimal o'sish sur'atlari bilan (5a-rasm). Asosiy komponentlar tahlili (PCA) GA signalizatsiya faolligi hujayra yuzasi o'sish intensivligi bilan salbiy bog'liqligini ko'rsatdi (5c-rasm). Shuningdek, biz GA signalizatsiya kirishi va o'sish intensivligini o'z ichiga olgan asosiy o'zgaruvchanlik o'qlari yuqori CLV3 ifodasi bilan aniqlangan yo'nalishga ortogonal ekanligini ko'rsatdik, bu qolgan tahlillarda hujayralarning SAM markazidan chiqarib tashlanishini tasdiqladi. Spearman korrelyatsiyasi tahlili PCA natijalarini tasdiqladi (5d-rasm), bu IPRdagi yuqori GA signallari hujayralarning yuqori kengayishiga olib kelmasligini ko'rsatadi. Biroq, korrelyatsiya tahlili GA signalizatsiya faolligi va o'sish anizotropiyasi o'rtasida ozgina ijobiy korrelyatsiyani aniqladi (5c, d-rasm), bu IPRdagi yuqori GA signalizatsiyasi hujayra o'sish yo'nalishiga va ehtimol hujayra bo'linish tekisligining holatiga ta'sir qilishini ko'rsatadi.
a, b SAMda o'rtacha sirt o'sishi (a) va o'sish anizotropiyasining (b) issiqlik xaritalari yettita mustaqil o'simlik bo'yicha o'rtacha hisoblangan (mos ravishda hujayra kengayishining kuchi va yo'nalishi uchun proksi sifatida ishlatilgan). c PCA tahlili quyidagi o'zgaruvchilarni o'z ichiga oldi: GA signali, sirt o'sishi intensivligi, sirt o'sishi anizotropiyasi va CLV3 ifodasi. PCA komponenti 1 asosan sirt o'sishi intensivligi bilan salbiy korrelyatsiya qilingan va GA signali bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan. PCA komponenti 2 asosan sirt o'sishi anizotropiyasi bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan va CLV3 ifodasi bilan salbiy korrelyatsiya qilingan. Foizlar har bir komponent tomonidan tushuntirilgan o'zgarishni ifodalaydi. d CZ ni hisobga olmaganda, to'qima shkalasida GA signali, sirt o'sishi intensivligi va sirt o'sishi anizotropiyasi o'rtasidagi Spearman korrelyatsiyasi tahlili. O'ngdagi raqam ikkita o'zgaruvchi orasidagi Spearman rho qiymatidir. Yulduzchalar korrelyatsiya/manfiy korrelyatsiya juda muhim bo'lgan holatlarni ko'rsatadi. e Konfokal mikroskopiya yordamida Col-0 SAM L1 hujayralarining 3D vizualizatsiyasi. SAMda (lekin primordiumda emas) 10 soat ichida hosil bo'lgan yangi hujayra devorlari burchak qiymatlariga qarab ranglanadi. Rang paneli pastki o'ng burchakda ko'rsatilgan. Qo'shimchada 0 soatdagi mos keladigan 3D tasvir ko'rsatilgan. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi. f Katakcha grafiklari IPR va IPR bo'lmagan Col-0 SAMda (n = 10 ta mustaqil o'simliklar) hujayra bo'linish tezligini ko'rsatadi. Markaziy chiziq medianani, katakcha chegaralari esa 25 va 75-persentillarni ko'rsatadi. Mo'ylovlar R dasturi bilan aniqlangan minimal va maksimal qiymatlarni ko'rsatadi. P qiymatlari Welchning ikki dumli t-testi yordamida olingan. g, h SAM markazidan (oq nuqtali chiziq) radial yo'nalishga nisbatan yangi hujayra devorining (qizil rang) burchagini qanday o'lchashni ko'rsatuvchi sxematik diagramma (g) (faqat o'tkir burchak qiymatlari, ya'ni 0–90° hisobga olinadi) va (h) meristema ichidagi aylana/lateral va radial yo'nalishlar. i SAM (to'q ko'k), IPR (o'rta ko'k) va IPR bo'lmagan (och ko'k) bo'ylab hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishining chastota gistogrammalari. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan. Tajriba ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi. j IPR ning P3 (och yashil), P4 (o'rta yashil) va P5 (to'q yashil) atrofidagi hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishining chastota gistogrammalari. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan. Tajriba ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi.
Shuning uchun, biz keyingi bosqichda tahlil davomida yangi hosil bo'lgan hujayra devorlarini aniqlash orqali GA signalizatsiyasi va hujayra bo'linishi faolligi o'rtasidagi bog'liqlikni o'rganib chiqdik (5e-rasm). Bu yondashuv bizga hujayra bo'linishining chastotasi va yo'nalishini o'lchash imkonini berdi. Ajablanarlisi shundaki, biz IPR va SAMning qolgan qismida (IPR bo'lmagan, 5f-rasm) hujayra bo'linish chastotasi o'xshash ekanligini aniqladik, bu IPR va IPR bo'lmagan hujayralar o'rtasidagi GA signalizatsiyasidagi farqlar hujayra bo'linishiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligini ko'rsatadi. Bu va GA signalizatsiyasi va o'sish anizotropiyasi o'rtasidagi ijobiy bog'liqlik bizni GA signalizatsiya faolligi hujayra bo'linishi tekisligining yo'nalishiga ta'sir qilishi mumkinmi yoki yo'qligini ko'rib chiqishga undadi. Biz yangi hujayra devorining yo'nalishini meristema markazi va yangi hujayra devorining markazini bog'laydigan radial o'qga nisbatan o'tkir burchak sifatida o'lchadik (5e-i-rasm) va hujayralarning radial o'qga nisbatan 90° ga yaqin burchak ostida bo'linishiga aniq moyillikni kuzatdik, eng yuqori chastotalar 70–80° (23,28%) va 80–90° (22,62%) da kuzatildi (5e,i-rasm), bu esa aylana/ko'ndalang yo'nalishdagi hujayra bo'linishiga mos keladi (5h-rasm). GA signalizatsiyasining ushbu hujayra bo'linish xatti-harakatlariga qo'shgan hissasini o'rganish uchun biz IPR va IPR bo'lmagan hujayra bo'linish parametrlarini alohida tahlil qildik (5i-rasm). Biz IPR hujayralaridagi bo'linish burchagi taqsimoti IPR bo'lmagan hujayralardagi yoki butun SAM hujayralaridagi taqsimotdan farq qilishini kuzatdik, IPR hujayralari lateral/dumaloq hujayra bo'linishlarining yuqori ulushini, ya'ni 70–80° va 80–90° (mos ravishda 33,86% va 30,71%) ko'rsatdi (5i-rasm). Shunday qilib, bizning kuzatishlarimiz yuqori GA signalizatsiyasi va GA signalizatsiya faolligi va o'sish anizotropiyasi o'rtasidagi korrelyatsiyaga o'xshash, aylana yo'nalishiga yaqin hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqladi (5c, d-rasm). Ushbu bog'liqlikning fazoviy saqlanishini yanada aniqlash uchun biz primordiumni o'rab turgan IPR hujayralarida bo'linish tekisligi yo'nalishini P3 dan boshlab o'lchadik, chunki eng yuqori GA signalizatsiya faolligi bu mintaqada P4 dan boshlab aniqlangan (4-rasm). IPR ning P3 va P4 atrofidagi bo'linish burchaklari statistik jihatdan sezilarli farqlarni ko'rsatmadi, garchi P4 atrofidagi IPRda lateral hujayra bo'linishlarining chastotasi oshgani kuzatilgan bo'lsa ham (5j-rasm). Biroq, P5 atrofidagi IPR hujayralarida hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishidagi farq statistik jihatdan ahamiyatli bo'lib, ko'ndalang hujayra bo'linish chastotasi keskin oshdi (5j-rasm). Birgalikda, bu natijalar GA signalizatsiyasi SAMda hujayra bo'linishlarining yo'nalishini boshqarishi mumkinligini ko'rsatadi, bu yuqori GA signalizatsiyasi IPRda hujayra bo'linishlarining lateral yo'nalishini keltirib chiqarishi mumkinligi haqidagi oldingi xabarlarga mos keladi40,41.
IPRdagi hujayralar primordiyaga emas, balki internoduklarga qo'shilishi taxmin qilinmoqda2,42,43. IPRdagi hujayra bo'linishlarining ko'ndalang yo'nalishi internoduklarda epidermal hujayralarning parallel bo'ylama qatorlarining odatiy tashkil etilishiga olib kelishi mumkin. Yuqorida tavsiflangan kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, GA signalizatsiyasi hujayra bo'linish yo'nalishini tartibga solish orqali bu jarayonda rol o'ynaydi.
Bir nechta DELLA genlarining funksiyasini yo'qotishi konstitutiv GA javobiga olib keladi va della mutantlari bu gipotezani sinab ko'rish uchun ishlatilishi mumkin44. Biz avval SAMdagi beshta DELLA genining ifoda naqshlarini tahlil qildik. GUS liniyasining45 transkripsiyaviy birlashishi GAI, RGA, RGL1 va RGL2 (ancha kam darajada) SAMda ifodalanganligini ko'rsatdi (Qo'shimcha 11a-d-rasm). In situ gibridizatsiyasi GAI mRNKsi, ayniqsa, primordiya va rivojlanayotgan gullarda to'planishini ko'rsatdi (Qo'shimcha 11e-rasm). RGL1 va RGL3 mRNKlari SAM soyaboni bo'ylab va eski gullarda aniqlandi, RGL2 mRNK esa chegara mintaqasida ko'proq edi (Qo'shimcha 11f-h-rasm). pRGL3::RGL3-GFP SAM ning konfokal tasviri in situ gibridizatsiyasi bilan kuzatilgan ifodani tasdiqladi va RGL3 oqsili SAMning markaziy qismida to'planishini ko'rsatdi (Qo'shimcha 11i-rasm). pRGA::GFP-RGA liniyasidan foydalanib, biz RGA oqsili SAMda to'planishini, ammo uning miqdori P4 dan boshlab chegarada kamayishini aniqladik (Qo'shimcha 11j-rasm). Shunisi e'tiborga loyiqki, RGL3 va RGA ning ifodalanish naqshlari qmRGA tomonidan aniqlanganidek, IPRdagi yuqori GA signalizatsiya faolligi bilan mos keladi (4-rasm). Bundan tashqari, bu ma'lumotlar barcha DELLAlar SAMda ifodalanganligini va ularning ifodalanishi birgalikda butun SAMni qamrab olishini ko'rsatadi.
Keyin biz yovvoyi tipdagi SAM (Ler, nazorat) va gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beshlik (global) mutantlarida hujayra bo'linish parametrlarini tahlil qildik (6a-rasm, b). Qizig'i shundaki, biz della global mutant SAMda yovvoyi tipga nisbatan hujayra bo'linish burchagi chastotalari taqsimotida statistik jihatdan sezilarli o'zgarishni kuzatdik (6c-rasm). Della global mutantidagi bu o'zgarish 80–90° burchaklar (34,71% vs. 24,55%) va kamroq darajada 70–80° burchaklar (23,78% vs. 20,18%) chastotasining oshishi bilan bog'liq edi, ya'ni ko'ndalang hujayra bo'linishlariga mos keladi (6c-rasm). Ko'ndalang bo'lmagan bo'linishlar chastotasi (0–60°) della global mutantida ham pastroq edi (6c-rasm). della global mutantining SAMida ko'ndalang hujayra bo'linish chastotasi sezilarli darajada oshdi (6b-rasm). IPRdagi ko'ndalang hujayra bo'linish chastotasi della global mutantida yovvoyi turga nisbatan yuqoriroq edi (6d-rasm). IPR mintaqasidan tashqarida yovvoyi tur hujayra bo'linish burchaklarining bir xil taqsimlanishiga ega edi, della global mutant esa IPR kabi tangensial bo'linishlarni afzal ko'rdi (6e-rasm). Shuningdek, biz GA to'planadigan GA-inaktiv mutant fon bo'lgan ga2 oksidaza (ga2ox) beshlik mutantlarining (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 va ga2ox6-2) SAMida hujayra bo'linishlarining yo'nalishini aniqladik. GA darajasining oshishi bilan mos ravishda, beshta ga2ox mutant inflorescence ning SAMi Col-0 nikidan kattaroq edi (Qo'shimcha 12a-rasm, b) va Col-0 bilan solishtirganda, beshta ga2ox SAM hujayra bo'linish burchaklarining aniq boshqacha taqsimlanishini ko'rsatdi, burchak chastotasi 50° dan 90° gacha oshdi, ya'ni yana tangensial bo'linishlarni qo'llab-quvvatladi (Qo'shimcha 12a–c-rasm). Shunday qilib, biz GA signalizatsiyasining konstitutiv faollashuvi va GA to'planishi IPR va SAMning qolgan qismida lateral hujayra bo'linishini keltirib chiqarishini ko'rsatamiz.
a, b Konfokal mikroskopiya yordamida PI bilan bo'yalgan Ler (a) va global della mutant (b) SAM ning L1 qatlamining 3D vizualizatsiyasi. 10 soatlik davrda SAMda (lekin primordiumda emas) hosil bo'lgan yangi hujayra devorlari ko'rsatilgan va ularning burchak qiymatlariga muvofiq ranglangan. Qo'shimchada SAM 0 soatda ko'rsatilgan. Rang paneli pastki o'ng burchakda ko'rsatilgan. (b) dagi strelka global della mutantidagi hizalangan hujayra fayllari misoliga ishora qiladi. Tajriba ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi. Ler va global della o'rtasidagi butun SAM (d), IPR (e) va IPR bo'lmagan (f) da hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishlarining chastota taqsimotini taqqoslash. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan. f, g Col-0 (i) va pCUC2::gai-1-VENUS (j) transgen o'simliklarining PI bilan bo'yalgan SAM ning konfokal tasvirlarining 3D vizualizatsiyasi. (a, b) panellari SAMda 10 soat ichida hosil bo'lgan yangi hujayra devorlarini (lekin primordiyalarni emas) ko'rsatadi. Tajriba ikki marta o'xshash natijalar bilan takrorlandi. h–j Col-0 va pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklari orasida butun SAM (h), IPR (i) va IPR bo'lmagan (j) da joylashgan hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishlarining chastota taqsimotini taqqoslash. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan.
Keyin biz GA signalizatsiyasini inhibe qilishning ta'sirini, xususan, IPRda sinab ko'rdik. Shu maqsadda biz VENUSga qo'shilgan dominant salbiy gai-1 oqsilining ekspressiyasini boshqarish uchun kotiledon kubogi 2 (CUC2) promouteridan foydalandik (pCUC2::gai-1-VENUS liniyasida). Yovvoyi turdagi SAMda CUC2 promouteri P4 dan boshlab chegara hujayralarini o'z ichiga olgan SAMdagi ko'pgina IPRlarning ekspressiyasini boshqaradi va shunga o'xshash o'ziga xos ekspressiya pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarida kuzatildi (pastga qarang). pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarining SAM yoki IPR bo'yicha hujayra bo'linish burchaklarining taqsimlanishi yovvoyi turdagi o'simliklarnikidan sezilarli darajada farq qilmadi, garchi kutilmaganda biz bu o'simliklarda IPR bo'lmagan hujayralar 80-90° yuqori chastotada bo'linishini aniqladik (6f-j-rasm).
Hujayra bo'linishi yo'nalishi SAM geometriyasiga, xususan, to'qima egriligi tomonidan hosil bo'lgan cho'zilish kuchlanishiga bog'liq deb taxmin qilingan46. Shuning uchun biz SAM shakli della global mutant va pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarida o'zgarganmi yoki yo'qmi, deb so'radik. Avval xabar qilinganidek12, della global mutant SAM ning hajmi yovvoyi turnikidan kattaroq edi (Qo'shimcha 13a, b, d-rasm). CLV3 va STM RNK ning in situ gibridlanishi della mutantlarida meristemaning kengayishini tasdiqladi va ildiz hujayrasi nishining lateral kengayishini ko'rsatdi (Qo'shimcha 13e, f, h, i-rasm). Biroq, SAM egriligi ikkala genotipda ham o'xshash edi (Qo'shimcha 13k-rasm, m, n, p). Biz gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della quadruple mutantida yovvoyi turga nisbatan egrilik o'zgarmasdan o'lchamning shunga o'xshash o'sishini kuzatdik (Qo'shimcha 13c-rasm, d, g, j, l, o, p). Hujayra bo'linishining chastotasi della quadruple mutantida ham ta'sirlangan, ammo della monolitik mutantga qaraganda kamroq darajada (Qo'shimcha 12d–f-rasm). Bu dozalash effekti, egrilikka ta'sirning yo'qligi bilan birga, Della quadruple mutantidagi qoldiq RGL3 faolligi DELLA faolligining yo'qolishi natijasida hujayra bo'linishi yo'nalishidagi o'zgarishlarni cheklashini va lateral hujayra bo'linishlaridagi o'zgarishlar SAM geometriyasidagi o'zgarishlarga emas, balki GA signalizatsiya faolligidagi o'zgarishlarga javoban sodir bo'lishini ko'rsatadi. Yuqorida tavsiflanganidek, CUC2 promouteri SAMda IPR ifodasini P4 dan boshlab boshqaradi (14a-qo'shimcha rasm, b) va aksincha, pCUC2::gai-1-VENUS SAM hajmi kichikroq, ammo egriligi yuqoriroq edi (14c-h-qo'shimcha rasm). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasidagi bu o'zgarish yovvoyi turga nisbatan mexanik kuchlanishlarning boshqacha taqsimlanishiga olib kelishi mumkin, bunda yuqori aylana kuchlanishlari SAM markazidan qisqaroq masofada boshlanadi47. Shu bilan bir qatorda, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasidagi o'zgarishlar transgen ifodasi48 tomonidan qo'zg'atilgan mintaqaviy mexanik xususiyatlarning o'zgarishi natijasida yuzaga kelishi mumkin. Ikkala holatda ham, bu hujayralarning aylana/ko'ndalang yo'nalishda bo'linish ehtimolini oshirish orqali GA signalizatsiyasidagi o'zgarishlarning ta'sirini qisman qoplashi mumkin, bu bizning kuzatishlarimizni tushuntiradi.
Umumiy holda, bizning ma'lumotlarimiz yuqori GA signalizatsiyasi IPRdagi hujayra bo'linish tekisligining lateral yo'nalishi bo'yicha faol rol o'ynashini tasdiqlaydi. Ular, shuningdek, meristem egriligi IPRdagi hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishiga ham ta'sir qilishini ko'rsatadi.
IPRdagi bo'linish tekisligining ko'ndalang yo'nalishi, yuqori GA signalizatsiya faolligi tufayli, GA keyinchalik epidermal internodeda topiladigan hujayra tuzilishini aniqlash uchun SAM ichidagi epidermisda radial hujayra faylini oldindan tashkil qilishini ko'rsatadi. Darhaqiqat, bunday hujayra fayllari della global mutantlarning SAM tasvirlarida tez-tez ko'rinib turardi (6b-rasm). Shunday qilib, SAMda GA signalizatsiyasining fazoviy naqshining rivojlanish funktsiyasini yanada chuqurroq o'rganish uchun biz yovvoyi tipdagi (Ler va Col-0), della global mutantlari va pCUC2::gai-1-VENUS transgen o'simliklaridagi IPRdagi hujayralarning fazoviy tuzilishini tahlil qilish uchun vaqt oralig'idagi tasvirlashdan foydalandik.
Biz qmRGA IPRdagi GA signalizatsiya faolligi P1/P2 dan oshib, P4 da eng yuqori cho'qqiga chiqqanligini ko'rsatganini va bu naqsh vaqt o'tishi bilan doimiy bo'lib qolganligini aniqladik (4a-f-rasm va 8c-f-rasm, k qo'shimcha). GA signalining ortishi bilan IPRdagi hujayralarning fazoviy tuzilishini tahlil qilish uchun biz Ler IPR hujayralarini P4 ning yuqorisida va yon tomonlariga ularning rivojlanish taqdiriga ko'ra birinchi kuzatuvdan 34 soat o'tgach tahlil qilingan, ya'ni ikki martadan ko'proq plastid marta belgiladik, bu bizga P1/P2 dan P4 gacha bo'lgan primordium rivojlanishi davomida IPR hujayralarini kuzatish imkonini berdi. Biz uch xil rangdan foydalandik: P4 yaqinidagi primordiumga birlashtirilgan hujayralar uchun sariq, IPRda bo'lganlar uchun yashil va ikkala jarayonda ishtirok etganlar uchun binafsha rang (7a-c-rasm). t0 da (0 soat) P4 oldida 1-2 qatlam IPR hujayralari ko'rinib turardi (7a-rasm). Kutilganidek, bu hujayralar bo'linganida, ular asosan ko'ndalang bo'linish tekisligi orqali bo'lindi (7a-c-rasmlar). Shunga o'xshash natijalar Col-0 SAM yordamida olingan (P3 ga e'tibor qaratgan holda, uning chegarasi Lerda P4 ga o'xshash tarzda buklanadi), garchi bu genotipda gul chegarasida hosil bo'lgan buklama IPR hujayralarini tezroq yashirgan bo'lsa ham (7g–i-rasm). Shunday qilib, IPR hujayralarining bo'linish shakli hujayralarni internodallardagi kabi radial qatorlarga oldindan tashkil qiladi. Radial qatorlarning tashkil etilishi va IPR hujayralarining ketma-ket organlar o'rtasida joylashishi bu hujayralar internodal ajdodlar ekanligini ko'rsatadi.
Bu yerda biz GA va GA retseptorlari konsentratsiyalarining kombinatsiyasi natijasida GA signalizatsiya faolligini miqdoriy xaritalash imkonini beruvchi, shu bilan birga endogen signalizatsiya yo'llariga xalaqitni minimallashtirishga imkon beruvchi va shu bilan hujayra darajasida GA funktsiyasi haqida ma'lumot beruvchi nisbatometrik GA signalizatsiya biosensorini, qmRGA ni ishlab chiqdik. Shu maqsadda biz DELLA o'zaro ta'sir sheriklarini bog'lash qobiliyatini yo'qotgan, ammo GA tomonidan qo'zg'atilgan proteolizga sezgir bo'lib qolgan modifikatsiyalangan DELLA oqsilini, mRGA ni yaratdik. qmRGA GA darajasidagi ekzogen va endogen o'zgarishlarga javob beradi va uning dinamik sezgirlik xususiyatlari rivojlanish jarayonida GA signalizatsiya faolligidagi fazoviy-vaqtinchalik o'zgarishlarni baholash imkonini beradi. qmRGA shuningdek, juda moslashuvchan vositadir, chunki uni ifoda etish uchun ishlatiladigan promotorni o'zgartirish orqali (agar kerak bo'lsa) turli to'qimalarga moslashtirish mumkin va GA signalizatsiya yo'lining va angiospermlar bo'ylab PFYRE motivining saqlanib qolganligini hisobga olsak, uni boshqa turlarga o'tkazish mumkin22. Bunga muvofiq, guruch SLR1 DELLA oqsilidagi (HYY497AAA) ekvivalent mutatsiya ham SLR1 ning o'sish repressor faolligini bostirishi va shu bilan birga uning GA vositachiligidagi degradatsiyasini mRGA23 ga o'xshash darajada biroz kamaytirishi ko'rsatildi. Shunisi e'tiborga loyiqki, Arabidopsisdagi so'nggi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, PFYRE domenidagi (S474L) bitta aminokislota mutatsiyasi RGA ning transkripsiya faolligini transkripsiya faktori hamkorlari50 bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyatiga ta'sir qilmasdan o'zgartirdi. Garchi bu mutatsiya mRGA da mavjud bo'lgan 3 ta aminokislota almashtirishiga juda yaqin bo'lsa-da, bizning tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bu ikki mutatsiya DELLA ning o'ziga xos xususiyatlarini o'zgartiradi. Transkripsiya faktori hamkorlarining aksariyati DELLA26,51 ning LHR1 va SAW domenlariga bog'lansa-da, PFYRE domenidagi ba'zi saqlanib qolgan aminokislotalar bu o'zaro ta'sirlarni barqarorlashtirishga yordam berishi mumkin.
Tugunlararo rivojlanish o'simlik arxitekturasi va hosildorlikni oshirishdagi asosiy xususiyatdir. qmRGA IPR tugunlararo progenitor hujayralarida yuqori GA signalizatsiya faolligini aniqladi. Miqdoriy tasvirlash va genetikani birlashtirib, biz GA signalizatsiya naqshlari SAM epidermisida dumaloq/ko'ndalang hujayra bo'linish tekisliklarini qoplashini va tugunlararo rivojlanish uchun zarur bo'lgan hujayra bo'linish tashkilotini shakllantirishini ko'rsatdik. Rivojlanish jarayonida hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishi bo'yicha bir nechta regulyatorlar aniqlandi52,53. Bizning ishimiz GA signalizatsiya faolligi ushbu hujayra parametrini qanday boshqarishining aniq misolini taqdim etadi. DELLA oldindan katlanadigan oqsil komplekslari bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin41, shuning uchun GA signalizatsiyasi kortikal mikrotubulalar yo'nalishiga bevosita ta'sir qilish orqali hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishini tartibga solishi mumkin40,41,54,55. Biz kutilmaganda SAMda yuqori GA signalizatsiya faolligining korrelyatsiyasi hujayra cho'zilishi yoki bo'linishi emas, balki faqat o'sish anizotropiyasi ekanligini ko'rsatdik, bu GA ning IPRdagi hujayra bo'linish yo'nalishiga bevosita ta'siri bilan mos keladi. Biroq, biz bu ta'sir bilvosita bo'lishi mumkinligini ham istisno qila olmaymiz, masalan, GA tomonidan qo'zg'atilgan hujayra devorining yumshatilishi56 vositachiligida. Hujayra devori xususiyatlarining o'zgarishi mexanik stressni keltirib chiqaradi57,58, bu shuningdek, kortikal mikrotubulalarning yo'nalishiga ta'sir qilish orqali hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishiga ta'sir qilishi mumkin39,46,59. GA tomonidan qo'zg'atilgan mexanik stressning va GA tomonidan mikrotubulalar yo'nalishini to'g'ridan-to'g'ri tartibga solishning birgalikdagi ta'siri internodlarni aniqlash uchun IPRda hujayra bo'linish yo'nalishi bo'yicha o'ziga xos naqshni yaratishda ishtirok etishi mumkin va bu g'oyani sinab ko'rish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Xuddi shunday, oldingi tadqiqotlar DELLA bilan o'zaro ta'sir qiluvchi TCP14 va 15 oqsillarining internod shakllanishini boshqarishdagi ahamiyatini ta'kidlagan60,61 va bu omillar internod rivojlanishini tartibga soluvchi va GA signalizatsiyasiga ta'sir qilishi ko'rsatilgan BREVIPEDICELLUS (BP) va PENNYWISE (PNY) bilan birgalikda GA ta'sirini vositachilik qilishi mumkin2,62. DELLlar brassinosteroid, etilen, jasmonik kislota va abssis kislotasi (ABA) signalizatsiya yo'llari bilan o'zaro ta'sir qilishini63,64 va bu gormonlar mikrotubulalar yo'nalishiga65 ta'sir qilishi mumkinligini hisobga olsak, GA ning hujayra bo'linishi yo'nalishiga ta'siri boshqa gormonlar orqali ham amalga oshirilishi mumkin.
Dastlabki sitologik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Arabidopsis SAM ning ichki va tashqi mintaqalari tugunlararo rivojlanish uchun zarurdir2,42. GA ichki to'qimalarda hujayra bo'linishini faol ravishda tartibga solishi12, SAMda meristema va tugunlararo o'lchamni tartibga solishda GA ning ikki tomonlama funktsiyasini qo'llab-quvvatlaydi. Yo'nalishli hujayra bo'linishi shakli ichki SAM to'qimasida ham qattiq tartibga solinadi va bu tartibga solish poyaning o'sishi uchun juda muhimdir52. GA ichki SAM tashkilotida hujayra bo'linish tekisligini yo'naltirishda ham rol o'ynaydimi yoki yo'qmi, shu bilan SAM ichidagi tugunlarning spetsifikatsiyasi va rivojlanishini sinxronlashtiradimi yoki yo'qligini o'rganish qiziqarli bo'ladi.
O'simliklar in vitro sharoitida tuproqda yoki 1% saxaroza va 1% agar (Sigma) bilan to'ldirilgan 1 ta Murashige-Skoog (MS) muhitida (Duchefa) standart sharoitlarda (16 soat yorug'lik, 22 °C) o'stirildi, gipokotil va ildiz o'sishi tajribalari bundan mustasno, bunda ko'chatlar doimiy yorug'lik va 22 °C ostida vertikal plastinkalarda o'stirildi. Nitrat tajribalari uchun o'simliklar uzoq kunlik sharoitlarda yetarli nitrat (0 yoki 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-suksinat, 1% saxaroza va 1% A-agar (Sigma) bilan to'ldirilgan modifikatsiyalangan MS muhitida (bioWORLD o'simlik muhiti) o'stirildi.
pDONR221 ga kiritilgan GID1a kDNKsi pUBQ10::GID1a-mCherry hosil qilish uchun pB7m34GW ga pDONR P4-P1R-pUBQ10 va pDONR P2R-P3-mCherry bilan rekombinatsiya qilindi. pDONR221 ga kiritilgan IDD2 DNKsi p35S:IDD2-RFP hosil qilish uchun pB7RWG266 ga rekombinatsiya qilindi. pGID1b::2xmTQ2-GID1b ni yaratish uchun GID1b kodlash mintaqasining yuqori qismida joylashgan 3,9 kb fragment va GID1b kDNK (1,3 kb) va terminator (3,4 kb) ni o'z ichiga olgan 4,7 kb fragment avval 3-qo'shimcha jadvaldagi primerlar yordamida kuchaytirildi va keyin mos ravishda pDONR P4-P1R (Thermo Fisher Scientific) va pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) ga kiritildi va nihoyat Gateway klonlash yordamida pDONR221 2xmTQ268 bilan pGreen 012567 maqsadli vektoriga qayta birlashtirildi. pCUC2::LSSmOrange ni yaratish uchun CUC2 promotor ketma-ketligi (ATG dan 3229 bp yuqorida), undan keyin N7 yadro lokalizatsiya signali va NOS transkripsiya terminatori bilan katta Stokes-shiftlangan mOrange (LSSmOrange)69 ning kodlash ketma-ketligi Gateway 3-fragment rekombinatsiya tizimi (Invitrogen) yordamida pGreen kanamitsin nishonga olish vektoriga yig'ildi. O'simlik ikkilik vektori Agrobacterium tumefaciens GV3101 shtammiga kiritildi va Nicotiana benthamiana barglariga Agrobacterium infiltratsiya usuli bilan va Arabidopsis thaliana Col-0 ga gulli botirish usuli bilan kiritildi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry va pCLV3::mCherry-NLS qmRGA mos ravishda mos ravishda chatishtirilgan F3 va F1 avlodlaridan ajratildi.
RNK in situ gibridizatsiyasi taxminan 1 sm uzunlikdagi novda uchlarida amalga oshirildi72, ular yig'ilib, darhol 4 °C gacha oldindan sovutilgan FAA eritmasida (3,7% formaldegid, 5% sirka kislotasi, 50% etanol) fiksatsiya qilindi. 2 × 15 daqiqalik vakuumli ishlov berishdan so'ng, fiksator almashtirildi va namunalar bir kechada inkubatsiya qilindi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 va RGL3 kDNKlari va ularning 3′-UTRlariga antisens zondlari Rosier va boshqalar tomonidan tasvirlanganidek, 3-qo'shimcha jadvalda ko'rsatilgan primerlar yordamida sintez qilindi73. Digoksigenin bilan belgilangan zondlar digoksigenin antitelolari (3000 marta suyultirish; Roche, katalog raqami: 11 093 274 910) yordamida immunodetektsiya qilindi va kesmalar 5-bromo-4-xloro-3-indolil fosfat (BCIP, 250 marta suyultirish)/nitroblue tetrazolium (NBT, 200 marta suyultirish) eritmasi bilan bo'yaldi.
Nashr vaqti: 2025-yil 10-fevral