Shoot apikal meristema (SAM) o'sishi ildiz arxitekturasi uchun juda muhimdir. O'simlik gormonlarigibberellinlar(GA) o'simliklar o'sishini muvofiqlashtirishda asosiy rol o'ynaydi, ammo ularning SAMdagi roli hali ham yaxshi tushunilmagan. Bu erda biz DELLA oqsilining GA transkripsiya javobidagi muhim tartibga solish funktsiyasini bostirish va GA tan olingandan keyin degradatsiyasini saqlab qolish uchun GA signalizatsiyasining ratsional metrik biosensorini ishlab chiqdik. Biz ushbu degradatsiyaga asoslangan biosensor rivojlanish jarayonida GA darajasidagi o'zgarishlarni va uyali sezgirlikni aniq qayd etishini ko'rsatamiz. Biz ushbu biosensordan SAMda GA signalizatsiya faoliyatini xaritalash uchun foydalandik. Biz yuqori GA signallari asosan tugunlararo hujayralar uchun kashshof bo'lgan organ primordiyalari orasida joylashgan hujayralarda mavjudligini ko'rsatamiz. Funktsiyani oshirish va yo'qotish yondashuvlaridan foydalangan holda, biz GA hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishini tartibga solishini, internodlarning kanonik uyali tashkilotini o'rnatishini va shu bilan SAMda internode spetsifikatsiyasini targ'ib qilishini ko'rsatamiz.
Kurtak cho'qqisida joylashgan o'simta apikal meristema (SAM) o'simlikning butun hayoti davomida modulli va iterativ tarzda lateral organlar va ildiz tugunlarini hosil qiluvchi ildiz hujayralari bo'shlig'ini o'z ichiga oladi. Bu takrorlanuvchi birliklar yoki o'simlik tugunlarining har biri tugunlarda tugunlararo va yon organlarni, barg qo'ltig'idagi qo'ltiq osti meristemalarini o'z ichiga oladi1. O'simlik tugunlarining o'sishi va tashkil etilishi rivojlanish jarayonida o'zgaradi. Arabidopsisda vegetativ davrda tugunlararo oʻsish susayadi, qoʻltiq osti meristemalari esa rozet barglari qoʻltigʻida harakatsiz holatda qoladi. Gul fazasiga oʻtishda SAM toʻpgul meristemasiga aylanib, choʻzilgan tugunlararo va qoʻltiq kurtaklari, gulbarglar qoʻltigʻida shoxchalar, keyinroq bargsiz gullar hosil qiladi2. Barglar, gullar va shoxlarning boshlanishini boshqaradigan mexanizmlarni tushunishda sezilarli yutuqlarga erishgan bo'lsak-da, internodlar qanday paydo bo'lishi haqida nisbatan kam narsa ma'lum.
GA ning fazoviy-vaqtincha taqsimlanishini tushunish bu gormonlarning turli to'qimalarda va turli rivojlanish bosqichlarida funktsiyalarini yaxshiroq tushunishga yordam beradi. O'z promouteri ta'sirida ifodalangan RGA-GFP sintezining degradatsiyasining vizualizatsiyasi ildizlardagi umumiy GA darajasini tartibga solish bo'yicha muhim ma'lumotlarni beradi15,16. Biroq, RGA ifodasi to'qimalarda o'zgarib turadi17 va GA18 tomonidan tartibga solinadi. Shunday qilib, RGA promouterining differentsial ifodasi RGA-GFP bilan kuzatilgan floresans naqshiga olib kelishi mumkin va shuning uchun bu usul miqdoriy emas. Yaqinda bioaktiv flüoresein (Fl) yorlig'i bo'lgan GA19,20 GA ning ildiz endokorteksida to'planishi va uning hujayra darajasining GA transporti bilan tartibga solinishini aniqladi. Yaqinda GA FRET sensori nlsGPS1 GA darajalari ildizlar, filamentlar va qorong'u o'sgan gipokotillarda hujayra uzayishi bilan bog'liqligini ko'rsatdi21. Biroq, biz ko'rganimizdek, GA kontsentratsiyasi GA signalizatsiya faoliyatini nazorat qiluvchi yagona parametr emas, chunki u murakkab sezish jarayonlariga bog'liq. Bu erda, DELLA va GA signalizatsiya yo'llari haqidagi tushunchamizga asoslanib, biz GA signalizatsiyasi uchun degradatsiyaga asoslangan nisbatli biosensorning ishlab chiqilishi va tavsifi haqida xabar beramiz. Ushbu miqdoriy biosensorni ishlab chiqish uchun biz floresan oqsilga birlashtirilgan va to'qimalarda hamma joyda ifodalangan mutant GA-sezgir RGA, shuningdek, GA-sezgir bo'lmagan floresan oqsildan foydalandik. Biz mutant RGA oqsil sintezi hamma joyda ifodalanganda endogen GA signalizatsiyasiga xalaqit bermasligini va bu biosensor GA kirish va GA signalini yuqori fazoviy o'lchamlari bilan sezgir apparatlar tomonidan qayta ishlash natijasida kelib chiqadigan signalizatsiya faoliyatini miqdoriy aniqlashi mumkinligini ko'rsatamiz. Biz ushbu biosensordan GA signalizatsiya faolligining fazoviy-vaqtincha taqsimlanishini xaritalash va GA SAM epidermisidagi hujayra xatti-harakatlarini qanday tartibga solishini aniqlash uchun foydalandik. Biz GA organ primordiyalari orasida joylashgan SAM hujayralarining bo'linish tekisligining yo'nalishini tartibga solishini ko'rsatamiz va shu bilan internodning kanonik uyali tashkilotini aniqlaydi.
Nihoyat, biz qmRGA o'sib borayotgan hipokotillar yordamida endogen GA darajasidagi o'zgarishlar haqida xabar bera oladimi, deb so'radik. Biz ilgari nitrat GA sintezini oshirish va o'z navbatida DELLA34 degradatsiyasini oshirish orqali o'sishni rag'batlantirishini ko'rsatdik. Shunga ko'ra, biz ko'p miqdorda nitrat ta'minoti (10 mM NO3−) ostida o'stirilgan pUBQ10::qmRGA ko'chatlarida gipokotil uzunligi nitrat etishmaydigan sharoitlarda o'stirilgan ko'chatlarga qaraganda ancha uzun ekanligini kuzatdik (Qo'shimcha rasm 6a). O'sish reaktsiyasiga mos ravishda, 10 mM NO3- sharoitida o'stirilgan ko'chatlarning gipokotillarida GA signallari nitratsiz o'stirilgan ko'chatlarga qaraganda yuqori edi (Qo'shimcha rasm. 6b, c). Shunday qilib, qmRGA shuningdek, GA konsentratsiyasidagi endogen o'zgarishlar natijasida kelib chiqqan GA signalidagi o'zgarishlarni kuzatish imkonini beradi.
QmRGA tomonidan aniqlangan GA signalizatsiya faolligi GA konsentratsiyasiga va GA idrokiga bog'liqligini tushunish uchun, sensor dizayni asosida kutilganidek, biz vegetativ va reproduktiv to'qimalarda uchta GID1 retseptorlarining ifodasini tahlil qildik. Ko'chatlarda GID1-GUS reportyor liniyasi GID1a va c ning kotiledonlarda yuqori darajada ifodalanganligini ko'rsatdi (3a-c-rasm). Bundan tashqari, barcha uchta retseptorlar barglarda, lateral ildiz primordiyasida, ildiz uchlarida (GID1b ildiz qopqog'idan tashqari) va qon tomir tizimida (3a-c-rasm) ifodalangan. Inflorescence SAMda biz faqat GID1b va 1c uchun GUS signallarini aniqladik (Qo'shimcha rasm 7a-c). In situ gibridizatsiyasi ushbu ifoda naqshlarini tasdiqladi va keyinchalik GID1c SAMda past darajalarda bir xilda ifodalanganligini ko'rsatdi, GID1b esa SAMning chetida yuqori ifodani ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm. 7d-l). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b translyatsion sintezi, shuningdek, GID1b ifodasining darajali diapazonini aniqladi, SAM markazida past yoki yo'q ifodadan organlar chegaralarida yuqori ifodagacha (Qo'shimcha rasm. 7m). Shunday qilib, GID1 retseptorlari to'qimalar bo'ylab va ichida bir xilda taqsimlanmagan. Keyingi tajribalarda biz GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) ning haddan tashqari ifodalanishi hipokotillarda qmRGA ning tashqi GA ilovasiga sezgirligini oshirganini ham kuzatdik (3d, e-rasm). Aksincha, hipokotilda qd17mRGA tomonidan o'lchangan floresans GA3 bilan davolashga befarq edi (3f-rasm, g). Ikkala tahlil uchun ko'chatlar sensorning tezkor harakatini baholash uchun yuqori konsentratsiyali GA (100 mkM GA3) bilan ishlov berildi, bu erda GID1 retseptorlari bilan bog'lanish qobiliyati kuchaygan yoki yo'qolgan. Birgalikda, bu natijalar qmRGA biosensorining GA va GA sensori sifatida birlashtirilgan funktsiyani bajarishini tasdiqlaydi va GID1 retseptorining differentsial ifodasi sensorning emissivligini sezilarli darajada o'zgartirishi mumkinligini ko'rsatadi.
Bugungi kunga qadar SAMda GA signallarining taqsimlanishi noaniqligicha qolmoqda. Shuning uchun biz L1 qatlamiga (epidermis; 4a, b-rasm, Usullar va qo'shimcha usullarga qarang) diqqatni qaratgan holda GA signalizatsiya faolligining yuqori aniqlikdagi miqdoriy xaritalarini hisoblash uchun qmRGA ifodalovchi o'simliklar va pCLV3::mCherry-NLS ildiz hujayra reportyoridan35 foydalandik. Bu erda pCLV3::mCherry-NLS ifodasi GA signalizatsiya faolligining fazoviy-vaqt taqsimotini tahlil qilish uchun sobit geometrik mos yozuvlar nuqtasini taqdim etdi37. GA lateral organlar rivojlanishi uchun zarur deb hisoblansa-da4, biz GA signallari P3 bosqichidan boshlab gulli primordiumda (P) past ekanligini kuzatdik (4a, b-rasm), yosh P1 va P2 primordiumlari esa markaziy mintaqadagi kabi o'rtacha faollikka ega (4a, b-rasm). Yuqori GA signalizatsiya faolligi organning primordium chegaralarida, P1/P2 dan (chegaraning yon tomonlarida) boshlanib, P4 da cho'qqisiga, shuningdek, primordiya o'rtasida joylashgan periferik mintaqaning barcha hujayralarida aniqlandi (4a, b va qo'shimcha rasm. 8a, b). Ushbu yuqori GA signalizatsiya faolligi nafaqat epidermisda, balki L2 va L3 yuqori qatlamlarida ham kuzatildi (Qo'shimcha rasm 8b). QmRGA yordamida SAMda aniqlangan GA signallarining namunasi ham vaqt o'tishi bilan o'zgarishsiz qoldi (Qo'shimcha rasm. 8c-f, k). Qd17mRGA konstruktsiyasi T3 o'simliklarining SAMda biz batafsil tavsiflagan beshta mustaqil chiziqdan tizimli ravishda pastga tushirilgan bo'lsa-da, biz pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP konstruktsiyasi bilan olingan floresans naqshlarini tahlil qila oldik (Qo'shimcha rasm. 8g-j, l). Ushbu nazorat chizig'ida SAMda faqat floresans nisbatidagi kichik o'zgarishlar aniqlandi, ammo SAM markazida biz TagBFP bilan bog'liq VENUSning aniq va kutilmagan pasayishini kuzatdik. Bu qmRGA tomonidan kuzatilgan signalizatsiya sxemasi mRGA-VENUSning GA ga bog'liq degradatsiyasini aks ettirishini tasdiqlaydi, ammo qmRGA meristem markazida GA signalizatsiya faolligini ortiqcha baholashi mumkinligini ko'rsatadi. Xulosa qilib aytganda, bizning natijalarimiz birinchi navbatda primordiyaning tarqalishini aks ettiruvchi GA signalizatsiya naqshini ochib beradi. In-primordial mintaqaning (IPR) bunday taqsimlanishi rivojlanayotgan primordium va markaziy mintaqa o'rtasida yuqori GA signalizatsiya faolligining bosqichma-bosqich o'rnatilishi bilan bog'liq bo'lib, ayni paytda primordiumdagi GA signalizatsiya faolligi pasayadi (4c, d-rasm).
GID1b va GID1c retseptorlarining taqsimlanishi (yuqoriga qarang) GA retseptorlarining differentsial ifodasi SAMda GA signalizatsiya faolligi naqshini shakllantirishga yordam berishini ko'rsatadi. Biz GA ning differentsial to'planishi ishtirok etishi mumkinmi, deb qiziqdik. Ushbu imkoniyatni tekshirish uchun biz nlsGPS1 GA FRET sensori21 dan foydalandik. 100 daqiqa davomida 10 mkM GA4+7 bilan ishlov berilgan nlsGPS1 SAM da faollashuv chastotasining oshishi aniqlandi (Qo'shimcha rasm 9a-e), bu nlsGPS1 ildizlarda bo'lgani kabi SAMdagi GA konsentratsiyasining o'zgarishiga javob berishini ko'rsatadi21. NlsGPS1 faollashuv chastotasining fazoviy taqsimoti SAMning tashqi qatlamlarida nisbatan past GA darajalarini aniqladi, ammo ular SAM markazida va chegaralarida ko'tarilganligini ko'rsatdi (4e-rasm va qo'shimcha 9a,c-rasm). Bu shuni ko'rsatadiki, GA ham SAMda qmRGA tomonidan aniqlangani bilan taqqoslanadigan fazoviy naqsh bilan taqsimlanadi. Qo'shimcha yondashuv sifatida biz SAM ni floresan GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) yoki faqat Fl bilan salbiy nazorat sifatida ko'rib chiqdik. Fl signali SAM bo'ylab, shu jumladan markaziy mintaqa va primordium bo'ylab, pastroq intensivlikda bo'lsa ham tarqatildi (4j-rasm va qo'shimcha 10d-rasm). Aksincha, uchta GA-Fl ham birinchi darajali chegaralarda va IPRning qolgan qismida turli darajada to'plangan, GA7-Fl esa IPRning eng katta domenida to'plangan (4k-rasm va qo'shimcha 10a,b-rasm). Floresans intensivligining miqdorini aniqlash IPR va IPR bo'lmagan intensivlik nisbati GA-Fl bilan ishlov berilgan SAMda Fl bilan ishlov berilgan SAMga nisbatan yuqori ekanligini ko'rsatdi (4l-rasm va qo'shimcha rasm. 10c). Birgalikda, bu natijalar organ chegarasiga eng yaqin joylashgan IPR hujayralarida GA yuqori konsentratsiyalarda mavjudligini ko'rsatadi. Bu shuni ko'rsatadiki, SAM GA signalizatsiya faolligi GA retseptorlarining differentsial ifodalanishidan va organ chegaralari yaqinidagi IPR hujayralarida GA ning differentsial to'planishidan kelib chiqadi. Shunday qilib, bizning tahlilimiz GA signalizatsiyasining kutilmagan fazoviy-vaqtinchalik naqshini aniqladi, SAM markazida va primordiumida past faollik va periferik mintaqada IPRda yuqori faollik.
SAMda differentsial GA signalizatsiya faoliyatining rolini tushunish uchun biz SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS ning real vaqtda vaqt oralig'ida tasvirlash yordamida GA signalizatsiya faolligi, hujayra kengayishi va hujayra bo'linishi o'rtasidagi korrelyatsiyani tahlil qildik. GA ning o'sishni tartibga solishdagi rolini hisobga olgan holda, hujayra kengayish parametrlari bilan ijobiy korrelyatsiya kutilgan edi. Shuning uchun biz birinchi navbatda GA signalizatsiya faolligi xaritalarini hujayra sirtining o'sish tezligi xaritalari (ma'lum bir hujayra va bo'linish paytida hujayralar kengayish kuchining proksi sifatida) va hujayra kengayishining yo'nalishini o'lchaydigan o'sish anizotropiyasi xaritalari bilan solishtirdik (bu erda ma'lum bir hujayra va bo'linishdagi qiz hujayralar uchun ham qo'llaniladi; usul va qo'shimcha 5a-rasm). SAM hujayralari yuzasining o'sish sur'ati bo'yicha bizning xaritalarimiz oldingi kuzatuvlarga mos keladi38,39, chegaradagi minimal o'sish sur'atlari va rivojlanayotgan gullarda maksimal o'sish sur'atlari (5a-rasm). Asosiy komponentlar tahlili (PCA) GA signalizatsiya faolligi hujayra yuzasi o'sish intensivligi bilan salbiy bog'liqligini ko'rsatdi (5c-rasm). Shuningdek, biz o'zgaruvchanlikning asosiy o'qlari, shu jumladan GA signalizatsiyasi kirishi va o'sish intensivligi yuqori CLV3 ifodasi bilan aniqlangan yo'nalishga ortogonal ekanligini ko'rsatdik, bu qolgan tahlillarda hujayralarni SAM markazidan chiqarib tashlashni tasdiqladi. Spearman korrelyatsiya tahlili PCA natijalarini tasdiqladi (5d-rasm), bu IPRdagi yuqori GA signallari yuqori hujayra kengayishiga olib kelmasligini ko'rsatdi. Shu bilan birga, korrelyatsiya tahlili GA signalizatsiya faolligi va o'sish anizotropiyasi o'rtasida ozgina ijobiy korrelyatsiyani aniqladi (5c, d-rasm), IPRda yuqori GA signalizatsiyasi hujayra o'sishi yo'nalishiga va, ehtimol, hujayra bo'linish tekisligining holatiga ta'sir qiladi.
a, b SAMda o'rtacha sirt o'sishi (a) va o'sish anizotropiyasining (b) issiqlik xaritalari ettita mustaqil o'simlikdan o'rtacha hisoblangan (mos ravishda hujayra kengayishining kuchi va yo'nalishi uchun proksi sifatida ishlatiladi). c PCA tahlili quyidagi o'zgaruvchilarni o'z ichiga oladi: GA signali, sirt o'sish intensivligi, sirt o'sishi anizotropiyasi va CLV3 ifodasi. PCA komponenti 1 asosan sirt o'sishi intensivligi bilan salbiy bog'liq edi va GA signali bilan ijobiy bog'liq edi. PCA komponenti 2 asosan sirt o'sishi anizotropiyasi bilan ijobiy korrelyatsiya qilingan va CLV3 ifodasi bilan salbiy bog'liq edi. Foizlar har bir komponent tomonidan tushuntirilgan o'zgarishlarni ifodalaydi. d GA signali, sirt o'sish intensivligi va CZ dan tashqari to'qima shkalasida sirt o'sishi anizotropiyasi o'rtasidagi Spearman korrelyatsiya tahlili. O'ngdagi raqam ikki o'zgaruvchi orasidagi Spearman rho qiymatidir. Yulduzchalar korrelyatsiya/salbiy korrelyatsiya juda muhim bo'lgan holatlarni ko'rsatadi. e Col-0 SAM L1 hujayralarining konfokal mikroskop yordamida 3D vizualizatsiyasi. 10 soatda SAMda hosil bo'lgan yangi hujayra devorlari (lekin primordium emas) burchak qiymatlariga ko'ra ranglanadi. Rang paneli pastki o'ng burchakda ko'rsatilgan. Inset 0 soatda mos keladigan 3D tasvirni ko'rsatadi. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi. f Box uchastkalari IPR va IPR bo'lmagan Col-0 SAM (n = 10 ta mustaqil o'simlik) da hujayra bo'linish tezligini ko'rsatadi. Markaziy chiziq medianani ko'rsatadi va quti chegaralari 25 va 75 foizlarni ko'rsatadi. Mo'ylovlar R dasturi bilan aniqlangan minimal va maksimal qiymatlarni bildiradi. P qiymatlari Welchning ikki dumli t-testi bilan olingan. g, h (g) SAM markazidan (oq nuqta chiziq) radial yo'nalishga nisbatan yangi hujayra devorining (qizil rang) burchagini qanday o'lchashni ko'rsatadigan sxematik diagramma (faqat o'tkir burchak qiymatlari, ya'ni 0-90 ° hisobga olinadi) va (h) meristema ichidagi aylana/lateral va radial yo'nalishlar. i SAM (to'q ko'k), IPR (o'rta ko'k) va IPR bo'lmagan (och ko'k) bo'ylab hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishining chastotali gistogrammalari. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi bilan olingan. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi. j P3 (ochiq yashil), P4 (o'rta yashil) va P5 (to'q yashil) atrofida IPRning hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishining chastotali gistogrammalari. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi bilan olingan. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi.
Shuning uchun biz tahlil davomida yangi hosil bo'lgan hujayra devorlarini aniqlash orqali GA signalizatsiyasi va hujayra bo'linish faolligi o'rtasidagi bog'liqlikni tekshirdik (5e-rasm). Ushbu yondashuv bizga hujayra bo'linish chastotasi va yo'nalishini o'lchash imkonini berdi. Ajablanarlisi shundaki, biz IPR va SAMning qolgan qismidagi hujayra bo'linishlarining chastotasi (IPR bo'lmagan, 5f-rasm) o'xshashligini aniqladik, bu IPR va IPR bo'lmagan hujayralar o'rtasidagi GA signalidagi farqlar hujayra bo'linishiga sezilarli ta'sir ko'rsatmasligini ko'rsatadi. Bu va GA signalizatsiyasi va o'sish anizotropiyasi o'rtasidagi ijobiy korrelyatsiya bizni GA signalizatsiya faoliyati hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishiga ta'sir qilishi mumkinligini ko'rib chiqishga undadi. Biz yangi hujayra devorining yo'nalishini meristem markazini va yangi hujayra devorining markazini (5e-i-rasm) bog'laydigan radial o'qga nisbatan o'tkir burchak sifatida o'lchadik va hujayralar radial o'qga nisbatan 90 ° ga yaqin burchak ostida bo'linish tendentsiyasini aniqladik, eng yuqori chastotalar 70-80 ° 8 ° (70-80%) va 23.28 ° da kuzatilgan. (22,62%) (5e, i-rasm), aylana / ko'ndalang yo'nalishdagi hujayra bo'linmalariga mos keladi (5h-rasm). GA signalining ushbu hujayra bo'linishi xatti-harakatlariga qo'shgan hissasini o'rganish uchun biz IPR va IPR bo'lmagan hujayra bo'linish parametrlarini alohida tahlil qildik (5i-rasm). Biz IPR hujayralarida bo'linish burchagi taqsimoti IPR bo'lmagan hujayralardagi yoki butun SAMdagi hujayralardagidan farq qilishini kuzatdik, IPR hujayralari lateral/dumaloq hujayra bo'linishlarining ko'proq qismini ko'rsatadi, ya'ni 70-80 ° va 80-90 ° (mos ravishda 33,86% va 30,71%, Fig5). Shunday qilib, bizning kuzatishlarimiz yuqori GA signalizatsiyasi va GA signalizatsiya faolligi va o'sish anizotropiyasi o'rtasidagi korrelyatsiyaga o'xshash aylana yo'nalishiga yaqin bo'lgan hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishi o'rtasidagi bog'liqlikni aniqladi (5c, d-rasm). Ushbu assotsiatsiyaning fazoviy saqlanishini yanada aniqlash uchun biz P3 dan boshlab primordiumni o'rab turgan IPR hujayralarida bo'linish tekisligi yo'nalishini o'lchadik, chunki bu mintaqada P4 dan boshlab eng yuqori GA signalizatsiya faolligi aniqlangan (4-rasm). P3 va P4 atrofida IPRning bo'linish burchaklari statistik jihatdan muhim farqlarni ko'rsatmadi, garchi P4 atrofida IPRda lateral hujayra bo'linishlarining ko'payishi kuzatilgan (5j-rasm). Biroq, P5 atrofidagi IPR hujayralarida hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishidagi farq statistik ahamiyatga ega bo'lib, ko'ndalang hujayra bo'linish chastotasining keskin ortishi bilan (5j-rasm). Birgalikda, bu natijalar GA signalizatsiyasi SAMdagi hujayra bo'linmalarining yo'nalishini boshqarishi mumkinligini ko'rsatadi, bu yuqori GA signalizatsiyasi IPRda hujayra bo'linmalarining lateral yo'nalishini keltirib chiqarishi mumkinligi haqidagi oldingi hisobotlarga mos keladi40,41.
Taxminlarga ko'ra, IPRdagi hujayralar primordiyaga emas, balki internodlarga qo'shiladi2,42,43. IPRda hujayra bo'linmalarining ko'ndalang yo'nalishi internodlarda epidermis hujayralarining parallel bo'ylama qatorlarini odatiy tarzda tashkil etishga olib kelishi mumkin. Yuqorida tavsiflangan kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, GA signalizatsiyasi hujayra bo'linish yo'nalishini tartibga solish orqali bu jarayonda rol o'ynaydi.
Bir nechta DELLA genlarining funktsiyasini yo'qotish konstitutsiyaviy GA javobiga olib keladi va bu gipotezani tekshirish uchun della mutantlaridan foydalanish mumkin44. Biz birinchi navbatda SAMda beshta DELLA genining ifoda naqshlarini tahlil qildik. GUS liniyasining transkripsiyaviy sintezi45 GAI, RGA, RGL1 va RGL2 (kamroq darajada) SAMda ifodalanganligini aniqladi (Qo'shimcha rasm. 11a-d). In situ gibridizatsiyasi GAI mRNKning maxsus primordiya va rivojlanayotgan gullarda to'planishini ko'rsatdi (Qo'shimcha 11e-rasm). RGL1 va RGL3 mRNK SAM soyabonida va eski gullarda aniqlangan, RGL2 mRNK esa chegara hududida ko'proq bo'lgan (Qo'shimcha rasm. 11f-h). pRGL3 :: RGL3-GFP SAM ning konfokal tasviri in situ gibridizatsiya natijasida kuzatilgan ifodani tasdiqladi va RGL3 oqsili SAM ning markaziy qismida to'planishini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm 11i). pRGA :: GFP-RGA liniyasidan foydalanib, biz RGA oqsili SAMda to'planishini aniqladik, lekin uning ko'pligi P4 dan boshlab chegarada kamayadi (Qo'shimcha rasm. 11j). Ta'kidlash joizki, RGL3 va RGA ifoda naqshlari qmRGA tomonidan aniqlangan IPRda yuqori GA signalizatsiya faolligiga mos keladi (4-rasm). Bundan tashqari, ushbu ma'lumotlar barcha DELLAlar SAMda ifodalanganligini va ularning ifodasi birgalikda butun SAMni qamrab olishini ko'rsatadi.
Keyinchalik biz yovvoyi tipdagi SAM (Ler, nazorat) va gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della beshlik (global) mutantlarda hujayra bo'linish parametrlarini tahlil qildik (6a, b-rasm). Qizig'i shundaki, biz yovvoyi turga nisbatan della global mutant SAMda hujayra bo'linish burchagi chastotalarini taqsimlashda statistik jihatdan muhim o'zgarishlarni kuzatdik (6c-rasm). Della global mutantidagi bu o'zgarish 80-90 ° burchaklar (34,71% ga nisbatan 24,55%) va kamroq darajada 70-80 ° burchaklar (23,78% ga nisbatan 20,18%), ya'ni ko'ndalang hujayra bo'linmalariga mos keladigan chastotaning ortishi bilan bog'liq edi (6c-rasm). Transvers bo'lmagan bo'linishlarning chastotasi (0-60 °) della global mutantida ham past edi (6c-rasm). Della global mutantining SAMida transvers hujayra bo'linishlarining chastotasi sezilarli darajada oshdi (6b-rasm). IPRda ko'ndalang hujayra bo'linishlarining chastotasi yovvoyi turga nisbatan della global mutantida ham yuqori bo'lgan (6d-rasm). IPR hududidan tashqarida, yovvoyi tur hujayra bo'linish burchaklarining bir xil taqsimlanishiga ega edi, della global mutant esa IPR kabi tangensial bo'linishlarni afzal ko'rdi (6e-rasm). Shuningdek, biz GA to'planadigan GA-faol mutant foni bo'lgan ga2 oksidaza (ga2ox) beshlik mutantlarining (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1 va ga2ox6-2) SAMdagi hujayra bo'linishlari yo'nalishini miqdoriy jihatdan aniqladik. GA darajasining o'sishiga mos ravishda, beshta ga2ox mutant inflorescence SAM Col-0 dan kattaroq edi (Qo'shimcha rasm. 12a, b) va Col-0 bilan solishtirganda, beshta ga2ox SAM hujayra bo'linish burchaklarining aniq boshqacha taqsimlanishini ko'rsatdi, chastota 0 dan 0 dan 0 ga oshadi. bo'linmalar (qo'shimcha rasm. 12a-c). Shunday qilib, biz GA signalizatsiyasining konstitutsiyaviy faollashuvi va GA to'planishi IPRda va SAMning qolgan qismida lateral hujayra bo'linishlarini keltirib chiqarishini ko'rsatamiz.
a, b Konfokal mikroskopiya yordamida PI-bo'yalgan Ler (a) va global della mutant (b) SAM ning L1 qatlamining 3D vizualizatsiyasi. 10 soat davomida SAMda hosil bo'lgan yangi hujayra devorlari (lekin primordium emas) burchak qiymatlariga ko'ra ko'rsatiladi va ranglanadi. Kiritilgan SAM ni 0 soatda ko'rsatadi. Rang paneli pastki o'ng burchakda ko'rsatiladi. (b) dagi strelka global della mutantidagi tekislangan hujayra fayllari misoliga ishora qiladi. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi. Ler va global della o'rtasida butun SAM (d), IPR (e) va IPR bo'lmagan (f) bo'yicha hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishlarining chastota taqsimotini taqqoslash. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan. f, g Col-0 (i) va pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) transgen o'simliklarining PI-bo'yalgan SAM konfokal tasvirlarining 3D vizualizatsiyasi. Panellar (a, b) 10 soat ichida SAMda hosil bo'lgan yangi hujayra devorlarini (lekin primordia emas) ko'rsatadi. Tajriba ikki marta takrorlandi va shunga o'xshash natijalarga erishildi. h–j Col-0 va pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklari o'rtasida butun SAM (h), IPR (i) va IPR bo'lmagan (j) da joylashgan hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishlarining chastota taqsimotini taqqoslash. P qiymatlari ikki dumli Kolmogorov-Smirnov testi yordamida olingan.
Keyinchalik biz IPRda GA signalini inhibe qilish ta'sirini sinab ko'rdik. Shu maqsadda biz VENERaga birlashtirilgan dominant salbiy gai-1 oqsilini ifodalash uchun (pCUC2::gai-1-VENUS liniyasida) kotiledon kubogi 2 (CUC2) promouteridan foydalandik. Yovvoyi tipdagi SAMda CUC2 promouteri P4 dan boshlab SAMdagi ko'pgina IPRlarni, shu jumladan chegara hujayralarini ifodalaydi va shunga o'xshash o'ziga xos ifoda pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarida kuzatilgan (pastga qarang). pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarining SAM yoki IPR bo'ylab hujayra bo'linish burchaklarining tarqalishi yovvoyi turdagi o'simliklardan sezilarli darajada farq qilmadi, garchi kutilmaganda biz bu o'simliklardagi IPRsiz hujayralar 80-90 ° yuqori chastotada bo'linganligini aniqladik (6f-j-rasm).
Hujayra bo'linish yo'nalishi SAMning geometriyasiga, xususan, to'qimalarning egriligi natijasida hosil bo'lgan valentlik kuchlanishiga bog'liqligi taxmin qilingan46. Shuning uchun biz della global mutant va pCUC2::gai-1-VENUS o'simliklarida SAM shakli o'zgarganmi yoki yo'qligini so'radik. Avval xabar qilinganidek12, della global mutant SAM hajmi yovvoyi turga qaraganda kattaroq edi (Qo'shimcha rasm 13a, b, d). CLV3 va STM RNK ning in situ gibridizatsiyasi della mutantlarida meristema kengayishini tasdiqladi va keyinchalik ildiz hujayra uyasining lateral kengayishini ko'rsatdi (Qo'shimcha rasm 13e, f, h, i). Biroq, SAM egriligi ikkala genotipda ham o'xshash edi (qo'shimcha rasm. 13k, m, n, p). Biz gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della to'rtburchak mutantida yovvoyi turga nisbatan egrilik o'zgarmagan holda hajmining xuddi shunday o'sishini kuzatdik (Qo'shimcha rasm. 13c, d, g, j, l, o, p). Hujayra bo'linish yo'nalishi chastotasi della to'rtta mutantda ham ta'sir ko'rsatdi, ammo della monolit mutantiga qaraganda kamroq darajada (Qo'shimcha rasm 12d-f). Ushbu dozalash effekti egrilikka ta'sir qilmasligi bilan birga, Della to'rtlik mutantidagi qoldiq RGL3 faolligi DELLA faolligining yo'qolishi natijasida yuzaga keladigan hujayra bo'linish yo'nalishidagi o'zgarishlarni cheklashini va lateral hujayra bo'linishlaridagi o'zgarishlar SAM geometriyasidagi o'zgarishlarga emas, balki GA signalizatsiya faolligidagi o'zgarishlarga javob berishini ko'rsatadi. Yuqorida aytib o'tilganidek, CUC2 promouteri P4 dan boshlab SAMda IPR ifodasini boshqaradi (Qo'shimcha rasm. 14a, b) va aksincha, pCUC2:: gai-1-VENUS SAM kichikroq o'lchamga ega, ammo egriligi yuqori edi (qo'shimcha rasm. 14c-h). pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasidagi bu o'zgarish mexanik kuchlanishlarning yovvoyi turga nisbatan boshqacha taqsimlanishiga olib kelishi mumkin, bunda yuqori aylana kuchlanishlari SAM markazidan qisqaroq masofada boshlanadi47. Shu bilan bir qatorda, pCUC2::gai-1-VENUS SAM morfologiyasidagi o'zgarishlar transgen ifodasi natijasida kelib chiqqan mintaqaviy mexanik xususiyatlarning o'zgarishi natijasida yuzaga kelishi mumkin48. Ikkala holatda ham, bu bizning kuzatishlarimizni tushuntirib, hujayralarning aylana/ko'ndalang yo'nalishda bo'linish ehtimolini oshirish orqali GA signalidagi o'zgarishlarning ta'sirini qisman qoplashi mumkin.
Birgalikda olingan ma'lumotlarimiz yuqori GA signalizatsiyasi IPRda hujayra bo'linish tekisligining lateral yo'nalishida faol rol o'ynashini tasdiqlaydi. Ular, shuningdek, meristema egriligi IPRda hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishiga ham ta'sir qilishini ko'rsatadi.
IPRda bo'linish tekisligining ko'ndalang yo'nalishi, yuqori GA signalizatsiya faolligi tufayli, GA keyinchalik epidermal internodada topiladigan uyali tashkilotni aniqlash uchun SAM ichidagi epidermisdagi radial hujayra faylini oldindan tashkil qiladi. Darhaqiqat, bunday hujayra fayllari della global mutantlarining SAM tasvirlarida tez-tez ko'rinib turardi (6b-rasm). Shunday qilib, SAMda GA signalizatsiyasining fazoviy naqshining rivojlanish funktsiyasini yanada o'rganish uchun biz yovvoyi tipdagi (Ler va Col-0), della global mutantlarida va pCUC2 :: gai-1-VENUS transgen o'simliklarida IPRdagi hujayralarning fazoviy tashkilotini tahlil qilish uchun vaqt oralig'idagi tasvirlardan foydalandik.
Biz qmRGA shuni ko'rsatdiki, IPRda GA signalizatsiya faolligi P1 / P2 dan oshdi va P4 ga cho'qqisiga chiqdi va bu naqsh vaqt o'tishi bilan doimiy bo'lib qoldi (4a-f-rasm va qo'shimcha 8c-f, k). GA signalining ortishi bilan IPRda hujayralarning fazoviy tashkil etilishini tahlil qilish uchun biz birinchi kuzatuvdan 34 soat o'tgach tahlil qilingan rivojlanish taqdiriga ko'ra P4 ning yuqori va yon tomonlariga Ler IPR hujayralarini belgiladik, ya'ni P1/P2 dan P4 gacha bo'lgan primordium rivojlanishida IPR hujayralarini kuzatish imkonini beradi. Biz uch xil rangdan foydalandik: P4 yaqinidagi primordiumga birlashtirilgan hujayralar uchun sariq, IPRda bo'lganlar uchun yashil va ikkala jarayonda ishtirok etganlar uchun binafsha rang (7a-c-rasm). T0 (0 soat) da P4 oldida IPR hujayralarining 1-2 qatlami ko'rindi (7a-rasm). Kutilganidek, bu hujayralar bo'linganda, ular buni asosan ko'ndalang bo'linish tekisligi orqali amalga oshirdilar (7a-c-rasm). Shunga o'xshash natijalar Col-0 SAM yordamida olingan (chegarasi Lerdagi P4 ga o'xshash bo'lgan P3 ga e'tibor qaratish), garchi bu genotipda gul chegarasida hosil bo'lgan burma IPR hujayralarini tezroq yashirgan (7g-i-rasm). Shunday qilib, IPR hujayralarining bo'linish sxemasi hujayralarni internodlarda bo'lgani kabi radial qatorlarga oldindan tashkil qiladi. Radial qatorlarning tashkil etilishi va IPR hujayralarining ketma-ket organlar o'rtasida joylashishi bu hujayralar internodal progenitatorlar ekanligini ko'rsatadi.
Bu erda biz endogen signalizatsiya yo'llari bilan shovqinni minimallashtirish va shu bilan hujayra darajasida GA funktsiyasi haqida ma'lumot berish bilan birga GA va GA retseptorlari kontsentratsiyasidan kelib chiqadigan GA signalizatsiya faolligini miqdoriy xaritalash imkonini beruvchi ratsionmetrik GA signalizatsiya biosensorini, qmRGAni ishlab chiqdik. Shu maqsadda biz o'zgartirilgan DELLA oqsilini, mRGAni yaratdik, u DELLA o'zaro ta'sir sheriklarini bog'lash qobiliyatini yo'qotdi, ammo GA-induktsiyali proteolizga sezgir bo'lib qolmoqda. qmRGA GA darajasidagi ekzogen va endogen o'zgarishlarga javob beradi va uning dinamik sezish xususiyatlari rivojlanish jarayonida GA signalizatsiya faolligidagi fazoviy vaqt o'zgarishlarini baholash imkonini beradi. qmRGA shuningdek, juda moslashuvchan vositadir, chunki uni ifodalash uchun ishlatiladigan promouterni o'zgartirish (agar kerak bo'lsa) orqali turli to'qimalarga moslashtirilishi mumkin va angiospermlar bo'ylab GA signalizatsiya yo'li va PFYRE motivining saqlanib qolgan tabiatini hisobga olgan holda, u boshqa turlarga o'tkazilishi mumkin22. Shunga mos ravishda, guruch SLR1 DELLA oqsilidagi (HYY497AAA) ekvivalent mutatsiya ham SLR1 ning o'sish repressor faolligini bostirishi va mRGA23 ga o'xshash uning GA vositachiligidagi degradatsiyasini biroz qisqartirishi ko'rsatilgan. Ta'kidlash joizki, Arabidopsisdagi so'nggi tadqiqotlar PFYRE domenidagi (S474L) bitta aminokislota mutatsiyasi RGA ning transkripsiyaviy faolligini uning transkripsiya omili sheriklari bilan o'zaro ta'sir qilish qobiliyatiga ta'sir qilmasdan o'zgartirganligini ko'rsatdi50. Garchi bu mutatsiya mRGAda mavjud bo'lgan 3 ta aminokislota almashtirishga juda yaqin bo'lsa-da, bizning tadqiqotlarimiz shuni ko'rsatadiki, bu ikki mutatsiya DELLA ning o'ziga xos xususiyatlarini o'zgartiradi. Ko'pgina transkripsiya omillari sheriklari DELLA26,51 ning LHR1 va SAW domenlari bilan bog'langan bo'lsa-da, PFYRE domenidagi ba'zi saqlanib qolgan aminokislotalar ushbu o'zaro ta'sirlarni barqarorlashtirishga yordam berishi mumkin.
Internode rivojlanishi o'simlik arxitekturasining asosiy xususiyati va hosildorlikni oshirishdir. qmRGA IPR internode progenitor hujayralarida yuqori GA signalizatsiya faolligini aniqladi. Miqdoriy ko'rish va genetikani birlashtirib, biz GA signalizatsiya naqshlari SAM epidermisida dumaloq / ko'ndalang hujayra bo'linish tekisliklarini qo'shib, internode rivojlanishi uchun zarur bo'lgan hujayra bo'linish tashkilotini shakllantirishini ko'rsatdik. Rivojlanish jarayonida hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishining bir nechta regulyatorlari aniqlangan52,53. Bizning ishimiz GA signalizatsiya faoliyati ushbu uyali parametrni qanday tartibga solishiga aniq misol beradi. DELLA oldindan qatlamlangan oqsil komplekslari bilan o'zaro ta'sir qilishi mumkin41, shuning uchun GA signalizatsiyasi kortikal mikrotubula orientatsiyasiga bevosita ta'sir qilish orqali hujayra bo'linish tekisligi yo'nalishini tartibga solishi mumkin40,41,54,55. Biz kutilmaganda SAMda yuqori GA signalizatsiya faolligining korrelyatsiyasi hujayraning cho'zilishi yoki bo'linishi emas, balki faqat o'sish anizotropiyasi ekanligini ko'rsatdik, bu GA ning IPRda hujayra bo'linishi yo'nalishiga bevosita ta'siriga mos keladi. Biroq, biz bu ta'sir bilvosita ham bo'lishi mumkinligini istisno qila olmaymiz, masalan, GA tomonidan induktsiya qilingan hujayra devorining yumshatilishiga yordam beradi56. Hujayra devori xususiyatlarining o'zgarishi mexanik stressni keltirib chiqaradi57,58, bu ham kortikal mikrotubulalar yo'nalishiga ta'sir qilish orqali hujayra bo'linish tekisligining yo'nalishiga ta'sir qilishi mumkin39,46,59. GA tomonidan qo'zg'atilgan mexanik stressning kombinatsiyalangan ta'siri va GA tomonidan mikrotubula yo'nalishini to'g'ridan-to'g'ri tartibga solish internodlarni aniqlash uchun IPRda hujayra bo'linishi yo'nalishining o'ziga xos naqshini yaratishda ishtirok etishi mumkin va bu fikrni sinab ko'rish uchun qo'shimcha tadqiqotlar talab etiladi. Xuddi shunday, oldingi tadqiqotlar DELLA bilan o'zaro ta'sir qiluvchi TCP14 va 15 oqsillarining internod shakllanishini nazorat qilishda muhimligini ta'kidladi60,61 va bu omillar tugunlararo rivojlanishini tartibga soluvchi BREVIPEDICELLUS (BP) va PENNYWISE (PNY) bilan birgalikda GA ta'sirida vositachilik qilishi mumkin va GA2 signalizatsiyasiga ta'sir qilishi ko'rsatilgan. DELLAlar brassinosteroid, etilen, yasmonik kislota va abscisik kislota (ABA) signalizatsiya yo'llari63,64 bilan o'zaro ta'sir qilishini va bu gormonlar mikrotubulalar yo'nalishiga ta'sir qilishi mumkinligini hisobga olsak65, GA ning hujayra bo'linishi yo'nalishiga ta'siri boshqa gormonlar tomonidan ham vositachilik qilishi mumkin.
Dastlabki sitologik tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, Arabidopsis SAM ning ichki va tashqi hududlari internode rivojlanishi uchun zarur2,42. GA ning ichki to'qimalarda hujayra bo'linishini faol ravishda tartibga solishi12 SAMda meristema va internod hajmini tartibga solishda GAning ikki tomonlama funktsiyasini qo'llab-quvvatlaydi. Hujayralarning yo'nalishli bo'linish naqshlari ichki SAM to'qimasida ham qattiq tartibga solinadi va bu tartibga solish ildiz o'sishi uchun zarurdir52. GA ichki SAM tashkilotida hujayra bo'linish tekisligini yo'naltirishda rol o'ynaydimi yoki yo'qligini tekshirish qiziqarli bo'ladi va shu bilan SAM ichidagi internodlarning spetsifikatsiyasi va rivojlanishini sinxronlashtiradi.
O'simliklar in vitro tuproqda yoki 1% saxaroza va 1% agar (Sigma) bilan to'ldirilgan 1x Murashige-Skoog (MS) muhitida (Duchefa) standart sharoitda (16 soat yorug'lik, 22 ° C), ko'chatlar doimiy yorug'lik va vertikal plitalarda o'stirilgan 2 ° C ostida o'stirilgan hipokotil va ildiz o'sishi tajribalari bundan mustasno. Nitrat tajribalari uchun o'simliklar uzoq kun sharoitida etarli nitrat (0 yoki 10 mM KNO3), 0,5 mM NH4-süksinat, 1% saxaroza va 1% A-agar (Sigma) bilan to'ldirilgan modifikatsiyalangan MS muhitida (bioWORLD o'simlik muhitida) o'stirildi.
pDONR221 ga kiritilgan GID1a cDNK pUBQ10 :: GID1a-mCherry hosil qilish uchun pDONR P4-P1R-pUBQ10 va pDONR P2R-P3-mCherry bilan pB7m34GW ga qayta birlashtirildi. pDONR221 ga kiritilgan IDD2 DNK p35S: IDD2-RFP hosil qilish uchun pB7RWG266 ga qayta birlashtirildi. pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b ni yaratish uchun GID1b kodlash hududining yuqori qismidagi 3,9 kb fragment va GID1b cDNA (1,3 kb) va terminator (3,4 kb) ni o'z ichiga olgan 4,7 kb fragment birinchi navbatda P3-ON4R dagi primerlar yordamida kuchaytirildi va keyin P3-R4 qo'shimchasiga kiritildi. (Thermo Fisher Scientific) va pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific) mos ravishda va nihoyat pDONR221 2xmTQ268 bilan Gateway klonlash yordamida pGreen 012567 maqsadli vektoriga qayta birlashtirildi. pCUC2::LSSmOrange hosil qilish uchun CUC2 promotorlar ketma-ketligi (ATG dan yuqori oqimida 3229 bp), undan keyin N7 yadroviy lokalizatsiya signali va NOS transkripsiyaviy terminatori bilan Stokesga siljigan katta mOrange (LSSmOrange) 69 kodlash ketma-ketligi pGreen fragmenti vektori yordamida pGreen fragmenti vektori yordamida yig'ildi. rekombinatsiya tizimi (Invitrogen). O‘simlikning ikkilik vektori Agrobacterium tumefaciens shtammi GV3101ga kiritildi va mos ravishda Agrobacterium infiltratsiya usuli bilan Nicotiana benthamiana barglariga va Arabidopsis thaliana Col-0 ga gulli botirish usuli bilan kiritildi. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry va pCLV3::mCherry-NLS qmRGA mos ravishda tegishli xochlarning F3 va F1 nasllaridan ajratilgan.
RNK in situ gibridizatsiyasi taxminan 1 sm uzunlikdagi kurtaklar uchlarida amalga oshirildi72, ular to'plandi va darhol FAA eritmasida (3,7% formaldegid, 5% sirka kislotasi, 50% etanol) 4 °C ga oldindan sovutildi. 2 × 15 daqiqali vakuumli davolanishdan so'ng, fiksator o'zgartirildi va namunalar bir kechada inkubatsiya qilindi. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2 va RGL3 cDNAlari va ularning 3′-UTRlariga antisens problari Rosier va boshq.73 tomonidan tavsiflanganidek, 3-jadvalda ko'rsatilgan primerlar yordamida sintez qilindi. Digoksigenin bilan etiketlangan zondlar digoksigenin antikorlari (3000 marta suyultirish; Roche, katalog raqami: 11 093 274 910) yordamida immunodetlangan va bo'limlar 5-bromo-4-xloro-3-indolil fosfat (BCIP-2-ko'llanish) bilan bo'yalgan. (NBT, 200 marta suyultirish) eritmasi.
Yuborilgan vaqt: 2025-yil 10-fevral