Qarag'ay nematodasi - qarag'ay o'rmoni ekotizimlarida jiddiy iqtisodiy yo'qotishlarga olib kelishi ma'lum bo'lgan karantin migratsiya qiluvchi endoparazit. Ushbu tadqiqotda galogenlangan indollarning qarag'ay nematodalariga qarshi nematotsid faolligi va ularning ta'sir mexanizmi ko'rib chiqiladi. 5-yodoindol va avermektinning (ijobiy nazorat) qarag'ay nematodalariga qarshi nematotsid faolligi past konsentratsiyalarda (10 mkg/ml) o'xshash va yuqori bo'lgan. 5-yodoindol unumdorlikni, reproduktiv faollikni, embrion va lichinka o'limini va harakatlanish xatti-harakatlarini kamaytirdi. Ligandlarning umurtqasizlarga xos glutamat bilan qoplangan xlorid kanal retseptorlari bilan molekulyar o'zaro ta'siri 5-yodoindol, avermektin singari, retseptorning faol markaziga mahkam bog'lanishi haqidagi fikrni qo'llab-quvvatlaydi. 5-yodoindol shuningdek, nematodalarda turli xil fenotipik deformatsiyalarni, jumladan, g'ayritabiiy organlarning qulashi/qisqarishi va vakuolizatsiyaning kuchayishini keltirib chiqardi. Bu natijalar vakuolalar nematodalarning metillanishi vositachiligidagi o'limida rol o'ynashi mumkinligini ko'rsatadi. Muhimi, 5-yodoindol ikkala o'simlik turiga (karam va turp) toksik emas edi. Shunday qilib, ushbu tadqiqot shuni ko'rsatadiki, atrof-muhit sharoitida yodoindolni qo'llash qarag'ay so'lishining shikastlanishini nazorat qilishi mumkin.
Qarag'ay yog'ochi nematodasi (Bursaphelenchus xylophilus) qarag'ay yog'ochi nematodalariga (PWN), qarag'ay o'rmoni ekotizimlariga jiddiy ekologik zarar yetkazishi ma'lum bo'lgan migratsiya qiluvchi endoparazit nematodalarga tegishli1. Qarag'ay yog'ochi nematodasi keltirib chiqaradigan qarag'ay so'lishi kasalligi (PWD) Osiyo va Yevropa kabi bir qancha qit'alarda jiddiy muammoga aylanib bormoqda va Shimoliy Amerikada nematoda olib kelingan qarag'ay turlarini yo'q qiladi1,2. Qarag'ay daraxtlarining kamayishi katta iqtisodiy muammo bo'lib, uning global miqyosda tarqalishi istiqboli xavotirli3. Quyidagi qarag'ay turlari nematoda tomonidan eng ko'p hujumga uchraydi: Pinus densiflora, Pinus sylvestris, Pinus thunbergii, Pinus koraiensis, Pinus thunbergii, Pinus thunbergii va Pinus radiata4. Qarag'ay nematodasi - bu infeksiyadan keyin bir necha hafta yoki oy ichida qarag'ay daraxtlarini o'ldirishi mumkin bo'lgan jiddiy kasallik. Bundan tashqari, qarag'ay nematodasining avj olishi turli xil ekotizimlarda keng tarqalgan, shuning uchun doimiy infeksiya zanjirlari yaratilgan1.
Burphalenchus xylophilus - Aphelenchoidea superoilasi va 102.5-kladega mansub karantin o'simlik-parazit nematodasi. Nematoda zamburug'lar bilan oziqlanadi va qarag'ay daraxtlarining yog'och to'qimalarida ko'payadi, to'rt xil lichinka bosqichiga o'tadi: L1, L2, L3, L4 va kattalar1,6. Oziq-ovqat tanqisligi sharoitida qarag'ay nematodasi ixtisoslashgan lichinka bosqichiga - dauerga o'tadi, u o'z vektori - qarag'ay po'stlog'i qo'ng'izi (Monochamus alternatus) bilan parazitlik qiladi va sog'lom qarag'ay daraxtlariga o'tadi. Sog'lom xo'jayinlarda nematodalar tezda o'simlik to'qimalari orqali ko'chib o'tadi va parenximatoz hujayralar bilan oziqlanadi, bu esa infeksiyadan keyin bir yil ichida bir qator yuqori sezuvchanlik reaksiyalariga, qarag'ayning so'lib qolishiga va o'limga olib keladi1,7,8.
Qarag'ay nematodalarini biologik nazorat qilish uzoq vaqtdan beri qiyinchilik tug'dirib kelmoqda, karantin choralari 20-asrga borib taqaladi. Qarag'ay nematodalarini nazorat qilishning hozirgi strategiyalari asosan kimyoviy ishlov berishni, jumladan, yog'ochni fumigatsiya qilishni va daraxt tanasiga nematotsidlarni implantatsiya qilishni o'z ichiga oladi. Eng ko'p ishlatiladigan nematotsidlar avermektin oilasiga mansub avermektin va avermektin benzoatdir. Bu qimmat kimyoviy moddalar ko'plab nematod turlariga qarshi juda samarali va ekologik jihatdan xavfsiz deb hisoblanadi9. Biroq, bu nematotsidlarni takroriy qo'llash deyarli shubhasiz chidamli qarag'ay nematodalarining paydo bo'lishiga olib keladigan selektsiya bosimini yaratishi kutilmoqda, bu esa asta-sekin avermektinlarga qarshilik ko'rsatgan bir nechta hasharot zararkunandalari, masalan, Leptinotarsa decemlineata, Plutella xylostella va Trichostrongylus colubriformis va Ostertagia circumcincta nematodalari uchun ko'rsatilganidek, deyarli shubhasiz chidamli qarag'ay nematodalarining paydo bo'lishiga olib keladi10,11,12. Shuning uchun, PVD ni nazorat qilish uchun muqobil, tejamkor va ekologik toza choralarni topish maqsadida qarshilik ko'rsatish naqshlarini muntazam ravishda o'rganish va nematotsidlarni doimiy ravishda tekshirish kerak. So'nggi o'n yilliklarda bir qator mualliflar nematodlarni nazorat qilish vositalari sifatida o'simlik ekstraktlari, efir moylari va uchuvchan moddalardan foydalanishni taklif qilishdi13,14,15,16.
Yaqinda biz Caenorhabditis elegans 17 da hujayralararo va qirolliklararo signalizatsiya molekulasi bo'lgan indolning nematotsid faolligini namoyish etdik. Indol mikrobial ekologiyada keng tarqalgan hujayra ichidagi signal bo'lib, mikrobial fiziologiya, spora hosil bo'lishi, plazmid barqarorligi, dori qarshiligi, biofilm hosil bo'lishi va virulentlikka ta'sir qiluvchi ko'plab funktsiyalarni boshqaradi 18, 19. Indol va uning hosilalarining boshqa patogen nematodalarga qarshi faolligi o'rganilmagan. Ushbu tadqiqotda biz 34 ta indolning qarag'ay nematodalariga qarshi nematotsid faolligini o'rgandik va eng kuchli 5-yodoindolning ta'sir mexanizmini mikroskopiya, vaqt oralig'idagi fotosurat va molekulyar dok tajribalari yordamida aniqladik va urug'larni unib chiqish tahlili yordamida uning o'simliklarga toksik ta'sirini baholadik.
Indolning yuqori konsentratsiyasi (>1,0 mM) nematodlarga nematotsid ta'sir ko'rsatishi haqida ilgari xabar berilgan edi17. B. xylophilus (aralash hayot bosqichlari) ni 1 mM da indol yoki 33 xil indol hosilalari bilan davolashdan so'ng, B. xylophilusning o'lim darajasi nazorat va davolangan guruhlarda tirik va o'lik nematodlarni sanash orqali o'lchandi. Beshta indol sezilarli nematotsid faolligini ko'rsatdi; davolanmagan nazorat guruhining omon qolish darajasi 24 soatdan keyin 95 ± 7% ni tashkil etdi. Sinovdan o'tgan 34 ta indoldan 1 mM da 5-yodoindol va 4-fluoroindol 100% o'limga olib keldi, 5,6-difluoroindigo, metilindol-7-karboksilat va 7-yodoindol esa taxminan 50% o'limga olib keldi (1-jadval).
5-yodoindolning qarag'ay daraxti nematodasining vakuola hosil bo'lishi va metabolizmiga ta'siri. (A) Avermektin va 5-yodoindolning kattalar erkak nematodalariga ta'siri, (B) L1 bosqich nematoda tuxumlari va (C) B. xylophilus metabolizmi, (i) 0 soat ichida vakuolalar kuzatilmadi, davolash natijasida (ii) vakuolalar, (iii) bir nechta vakuolalarning to'planishi, (iv) vakuolalarning shishishi, (v) vakuolalarning birlashishi va (vi) ulkan vakuolalarning hosil bo'lishi kuzatildi. Qizil strelkalar vakuolalarning shishishini, ko'k strelkalar vakuolalarning birlashishini va qora strelkalar ulkan vakuolalarni ko'rsatadi. Masshtab chizig'i = 50 mkm.
Bundan tashqari, ushbu tadqiqotda qarag'ay nematodalarida metan keltirib chiqaradigan o'limning ketma-ket jarayoni ham tasvirlangan (4C-rasm). Metanogen o'lim - bu sitoplazmatik vakuolalarning to'planishi bilan bog'liq bo'lgan apoptotik bo'lmagan hujayra o'limi turi27. Qarag'ay nematodalarida kuzatilgan morfologik nuqsonlar metan keltirib chiqaradigan o'lim mexanizmi bilan chambarchas bog'liq ko'rinadi. Turli vaqtlardagi mikroskopik tekshiruv shuni ko'rsatdiki, 5-iodoindol (0,1 mM) ta'sirida 20 soatdan keyin ulkan vakuolalar hosil bo'lgan. Mikroskopik vakuolalar 8 soatlik davolashdan keyin kuzatildi va ularning soni 12 soatdan keyin ko'paydi. 14 soatdan keyin bir nechta katta vakuolalar kuzatildi. 12-16 soatlik davolashdan keyin bir nechta birlashgan vakuolalar aniq ko'rinib turdi, bu vakuollarning birlashishi metanogen o'lim mexanizmining asosi ekanligini ko'rsatadi. 20 soatdan keyin chuvalchang bo'ylab bir nechta ulkan vakuolalar topildi. Bu kuzatuvlar C. elegansda metuozning birinchi hisobotini ifodalaydi.
5-yodoindol bilan ishlov berilgan qurtlarda vakuolalarning agregatsiyasi va yorilishi ham kuzatildi (5-rasm), bu qurtlarning egilishi va vakuolalarning atrof-muhitga chiqishi bilan tasdiqlanadi. Tuxum qobig'i membranasida ham vakuolalarning buzilishi kuzatildi, u odatda tuxumdan chiqish paytida L2 tomonidan butun holda saqlanadi (Qo'shimcha S2-rasm). Bu kuzatishlar suyuqlik to'planishi va osmoregulyatsiya etishmovchiligining, shuningdek, qaytariladigan hujayra shikastlanishining (RCI) vakuola hosil bo'lishi va yiringlash jarayonida ishtirok etishini tasdiqlaydi (5-rasm).
Kuzatilgan vakuola hosil bo'lishida yodning rolini gipoteza qilib, biz natriy yodid (NaI) va kaliy yodid (KI) ning nematotsid faolligini o'rganib chiqdik. Biroq, konsentratsiyalarda (0,1, 0,5 yoki 1 mM) ular nematodlarning omon qolishiga yoki vakuolalarning hosil bo'lishiga ta'sir qilmadi (Qo'shimcha S5-rasm), garchi 1 mM KI ozgina nematotsid ta'sirga ega bo'lsa ham. Boshqa tomondan, 7-yodoindol (1 yoki 2 mM), 5-yodoindol singari, bir nechta vakuolalar va strukturaviy deformatsiyalarni keltirib chiqardi (Qo'shimcha S6-rasm). Ikkala yodoindol qarag'ay nematodlarida o'xshash fenotipik xususiyatlarni ko'rsatdi, NaI va KI esa bunday qilmadi. Qizig'i shundaki, indol sinovdan o'tgan konsentratsiyalarda B. xylophilusda vakuolalarning hosil bo'lishini keltirib chiqarmadi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Shunday qilib, natijalar indol-yod kompleksi B. xylophilusning vakuollanishi va metabolizmi uchun javobgar ekanligini tasdiqladi.
Nematotsid faolligi tekshirilgan indollardan 5-yodoindol eng yuqori sirpanish indeksiga ega bo'lib, -5,89 kkal/mol ni tashkil etdi, undan keyin 7-yodoindol (-4,48 kkal/mol), 4-fluoroindol (-4,33) va indol (-4,03) (6-rasm). 5-yodoindolning leytsin 218 bilan kuchli orqa miya vodorod bog'lanishi uning bog'lanishini barqarorlashtiradi, boshqa barcha indol hosilalari esa yon zanjirli vodorod bog'lanishlari orqali serin 260 bilan bog'lanadi. Boshqa modellashtirilgan yodoindollardan tashqari, 2-yodoindolning bog'lanish qiymati -5,248 kkal/mol ni tashkil qiladi, bu uning leytsin 218 bilan asosiy vodorod bog'lanishiga bog'liq. Boshqa ma'lum bog'lanishlar qatoriga 3-yodoindol (-4,3 kkal/mol), 4-yodoindol (-4,0 kkal/mol) va 6-fluoroindol (-2,6 kkal/mol) kiradi (Qo'shimcha S8-rasm). Ko'pgina galogenlangan indol va indolning o'zi, 5-yodoindol va 2-yodoindoldan tashqari, serin 260 bilan bog'lanish hosil qiladi. Leytsin 218 bilan vodorod bog'lanishi retseptor-ligandning samarali bog'lanishidan dalolat berishi, ivermektin uchun kuzatilganidek (Qo'shimcha S7-rasm), 5-yodoindol va 2-yodoindol, ivermektin singari, leytsin 218 orqali GluCL retseptorining faol joyiga mahkam bog'lanishini tasdiqlaydi (6-rasm va S8-qo'shimcha rasm). Biz bu bog'lanish GluCL kompleksining ochiq g'ovak tuzilishini saqlab qolish uchun zarur deb hisoblaymiz va GluCL retseptorining faol joyiga mahkam bog'lanish orqali 5-yodoindol, 2-yodoindol, avermektin va ivermektin ion kanalini ochiq holda ushlab turadi va suyuqlikning so'rilishini ta'minlaydi.
Indol va galogenlangan indolning GluCL ga molekulyar joylashishi. (A) indol, (B) 4-fluoroindol, (C) 7-yodoindol va (D) 5-yodoindol ligandlarining GluCL ning faol markaziga bog'lanish yo'nalishlari. Oqsil lenta bilan ifodalangan va asosiy vodorod bog'lanishlari sariq nuqta chiziqlar sifatida ko'rsatilgan. (A′), (B′), (C′) va (D′) mos keladigan ligandlarning atrofdagi aminokislota qoldiqlari bilan o'zaro ta'sirini ko'rsatadi va yon zanjirli vodorod bog'lanishlari pushti nuqta strelkalar bilan ko'rsatilgan.
5-yodoindolning karam va turp urug'larining unib chiqishiga toksik ta'sirini baholash uchun tajribalar o'tkazildi. 5-yodoindol (0,05 yoki 0,1 mM) yoki avermektin (10 mkg/ml) dastlabki unib chiqish va ko'chatlarning paydo bo'lishiga deyarli ta'sir ko'rsatmadi (7-rasm). Bundan tashqari, ishlov berilmagan nazorat guruhining unib chiqish tezligi va 5-yodoindol yoki avermektin bilan ishlov berilgan urug'lar o'rtasida sezilarli farq topilmadi. Ildizning cho'zilishi va hosil bo'lgan lateral ildizlar soniga ta'siri ahamiyatsiz edi, garchi 5-yodoindolning 1 mM (uning faol konsentratsiyasidan 10 baravar) lateral ildizlarning rivojlanishini biroz kechiktirgan bo'lsa ham. Bu natijalar shuni ko'rsatadiki, 5-yodoindol o'simlik hujayralari uchun toksik emas va o'rganilgan konsentratsiyalarda o'simliklarning rivojlanish jarayonlariga xalaqit bermaydi.
5-yodoindolning urug'ning unib chiqishiga ta'siri. Murashige va Skoog agar muhitida avermektin yoki 5-yodoindol qo'shilgan yoki qo'shilmagan holda B. oleracea va R. raphanistrum urug'larining unib chiqishi, unib chiqishi va lateral ildiz otishi. Unib chiqish 22°C da 3 kunlik inkubatsiyadan so'ng qayd etildi.
Ushbu tadqiqotda indollarning nematodlarni o'ldirishining bir nechta holatlari haqida xabar berilgan. Muhimi, bu qarag'ay ignalarida yodoindolning metillanishni keltirib chiqarishi (asta-sekin ulkan vakuolalarga birlashib, oxir-oqibat membrananing yorilishi va o'limiga olib keladigan kichik vakuolalarning to'planishi natijasida yuzaga keladigan jarayon) haqidagi birinchi hisobot bo'lib, yodoindol tijorat nematotsidi avermektiniga o'xshash sezilarli nematotsid xususiyatlarini namoyish etadi.
Indollarning prokaryotlar va eukaryotlarda biofilmni inhibe qilish/hosil bo'lishi, bakteriyalarning omon qolishi va patogenlik kabi ko'p signalizatsiya funktsiyalarini bajarishi haqida ilgari xabar berilgan edi19,32,33,34. Yaqinda galogenlangan indollarning, indol alkaloidlarining va yarim sintetik indol hosilalarining potentsial terapevtik ta'siri keng tadqiqotlar qiziqishini uyg'otdi35,36,37. Masalan, galogenlangan indollarning doimiy Escherichia coli va Staphylococcus aureus hujayralarini o'ldirishi ko'rsatilgan37. Bundan tashqari, galogenlangan indollarning boshqa turlar, turklar va qirolliklarga qarshi samaradorligini o'rganish ilmiy qiziqish uyg'otadi va ushbu tadqiqot ushbu maqsadga erishish yo'lidagi qadamdir.
Bu yerda biz C. elegansda 5-yodoindol keltirib chiqaradigan o'lim mexanizmini qaytariladigan hujayra shikastlanishi (RCI) va metillanishga asoslangan holda taklif qilamiz (4C va 5-rasmlar). Shishish va vakuolyar degeneratsiya kabi shishgan o'zgarishlar RCI va metillanishning ko'rsatkichlari bo'lib, sitoplazmada ulkan vakuolalar sifatida namoyon bo'ladi48,49. RCI ATP ishlab chiqarishni kamaytirish, ATFaza nasosining ishdan chiqishiga olib kelishi yoki hujayra membranalarini buzishi va Na+, Ca2+ va suvning tez oqishiga olib kelishi orqali energiya ishlab chiqarishga xalaqit beradi50,51,52. Intrasitoplazmatik vakuolalar hayvon hujayralarida Ca2+ va suvning oqib kelishi tufayli sitoplazmada suyuqlik to'planishi natijasida paydo bo'ladi53. Qizig'i shundaki, agar zarar vaqtinchalik bo'lsa va hujayralar ma'lum vaqt davomida ATP ishlab chiqarishni boshlasa, hujayralar shikastlanishining bu mexanizmi qaytarilishi mumkin, ammo agar zarar davom etsa yoki yomonlashsa, hujayralar o'ladi.54 Bizning kuzatishlarimiz shuni ko'rsatadiki, 5-iodoindol bilan davolangan nematodalar stress sharoitlariga duchor bo'lgandan keyin normal biosintezni tiklay olmaydi.
B. xylophilusda 5-yodoindol tomonidan qo'zg'atilgan metillanish fenotipi yodning mavjudligi va uning molekulyar taqsimlanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin, chunki 7-yodoindol B. xylophilusga 5-yodoindolga qaraganda kamroq inhibitiv ta'sir ko'rsatdi (1-jadval va S6-qo'shimcha rasm). Bu natijalar qisman Maltese va boshqalarning (2014) tadqiqotlari bilan mos keladi, ular indoldagi piridil azot qismining para- pozitsiyadan meta- pozitsiyaga o'tishi U251 hujayralarida vakuolizatsiya, o'sish inhibisyonini va sitotoksiklikni yo'q qilganini xabar qilishdi, bu molekulaning oqsildagi ma'lum bir faol joy bilan o'zaro ta'siri juda muhimligini ko'rsatadi27,44,45. Ushbu tadqiqotda kuzatilgan indol yoki galogenlangan indol va GluCL retseptorlari o'rtasidagi o'zaro ta'sirlar ham bu fikrni qo'llab-quvvatlaydi, chunki 5- va 2-yodoindol tekshirilgan boshqa indollarga qaraganda GluCL retseptorlariga kuchliroq bog'lanishi aniqlandi (6-rasm va S8-qo'shimcha rasm). Indolning ikkinchi yoki beshinchi pozitsiyasidagi yod GluCL retseptorining leytsin 218 bilan asosiy vodorod bog'lanishlari orqali bog'lanishi aniqlandi, boshqa galogenlangan indol va indolning o'zi esa serin 260 bilan kuchsiz yon zanjirli vodorod bog'lanishlarini hosil qiladi (6-rasm). Shuning uchun biz galogenning lokalizatsiyasi vakuolyar degeneratsiyani induktsiyalashda muhim rol o'ynaydi, 5-yodoindolning qattiq bog'lanishi esa ion kanalini ochiq ushlab turadi, shu bilan suyuqlikning tez oqib kelishi va vakuolalarning yorilishiga imkon beradi, deb taxmin qilamiz. Biroq, 5-yodoindolning batafsil ta'sir mexanizmi hali aniqlanmagan.
5-yodoindolni amaliy qo'llashdan oldin uning o'simliklarga toksik ta'sirini tahlil qilish kerak. Urug'larni unib chiqish bo'yicha tajribalarimiz shuni ko'rsatdiki, 5-yodoindol o'rganilgan konsentratsiyalarda urug'larni unib chiqishga yoki keyingi rivojlanish jarayonlariga salbiy ta'sir ko'rsatmadi (7-rasm). Shunday qilib, ushbu tadqiqot qarag'ay nematodalarining qarag'ay daraxtlariga zararli ta'sirini nazorat qilish uchun ekologik muhitda 5-yodoindoldan foydalanish uchun asos yaratadi.
Avvalgi hisobotlarda indol asosidagi terapiya antibiotiklarga chidamlilik va saraton rivojlanishi muammosini hal qilishning potentsial yondashuvi ekanligi ko'rsatilgan55. Bundan tashqari, indollarda antibakterial, saratonga qarshi, antioksidant, yallig'lanishga qarshi, diabetga qarshi, virusga qarshi, antiproliferativ va silga qarshi ta'sirlar mavjud bo'lib, dori vositalarini ishlab chiqish uchun istiqbolli asos bo'lib xizmat qilishi mumkin56,57. Ushbu tadqiqot birinchi marta yodning parazitlarga qarshi va gelmintlarga qarshi vosita sifatida qo'llanilishi mumkinligini ko'rsatmoqda.
Avermektin uch o'n yil oldin kashf etilgan va 2015-yilda Nobel mukofotiga sazovor bo'lgan va uni anthelmintic sifatida qo'llash hali ham faol davom etmoqda. Biroq, nematodalar va hasharotlar zararkunandalarida avermektinlarga chidamlilikning tez rivojlanishi tufayli qarag'ay daraxtlarida PWN infektsiyasini nazorat qilish uchun muqobil, arzon va ekologik toza strategiya zarur. Ushbu tadqiqotda shuningdek, 5-yodoindolning qarag'ay nematodalarini o'ldirish mexanizmi va 5-yodoindolning o'simlik hujayralari uchun past toksikligi haqida ham ma'lumot berilgan, bu esa uni kelajakda tijorat maqsadlarida qo'llash uchun yaxshi istiqbollarni ochadi.
Barcha tajribalar Koreyaning Gyeongsan shahridagi Yeungnam universitetining axloq qo'mitasi tomonidan tasdiqlangan va usullar Yeungnam universitetining axloq qo'mitasi ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirilgan.
Tuxum inkubatsiya tajribalari belgilangan protseduralar yordamida o'tkazildi43. Enkübasyon tezligini (HR) baholash uchun 1 kunlik kattalar nematodalari (taxminan 100 urg'ochi va 100 erkak) qo'ziqorin solingan Petri kosachalariga o'tkazildi va 24 soat davomida o'stirishga ruxsat berildi. Keyin tuxumlar ajratib olindi va steril distillangan suvda suspenziya sifatida 5-iodoindol (0,05 mM va 0,1 mM) yoki avermektin (10 mkg/ml) bilan ishlov berildi. Bu suspenziyalar (500 mkl; taxminan 100 ta tuxum) 24 teshikli to'qima madaniyati plastinkasining teshiklariga o'tkazildi va 22 °C da inkubatsiya qilindi. L2 hisoblari 24 soatlik inkubatsiyadan so'ng amalga oshirildi, ammo agar hujayralar ingichka platina sim bilan stimulyatsiya qilinganda harakatlanmasa, o'lik deb hisoblandi. Bu tajriba ikki bosqichda, har biri oltita takrorlanish bilan o'tkazildi. Ikkala tajribadan olingan ma'lumotlar birlashtirildi va taqdim etildi. HR foizi quyidagicha hisoblanadi:
Lichinkalarning o'limi avval ishlab chiqilgan protseduralar yordamida baholandi. Nematod tuxumlari to'plandi va embrionlar L2 bosqichli lichinkalarni hosil qilish uchun steril distillangan suvda chiqish orqali sinxronlashtirildi. Sinxronlashtirilgan lichinkalar (taxminan 500 ta nematod) 5-iodoindol (0,05 mM va 0,1 mM) yoki avermektin (10 mkg/ml) bilan ishlov berildi va B. cinerea Petri plastinkalarida o'stirildi. 22 °C da 48 soatlik inkubatsiyadan so'ng, nematodlar steril distillangan suvda to'plandi va L2, L3 va L4 bosqichlarining mavjudligi tekshirildi. L3 va L4 bosqichlarining mavjudligi lichinka transformatsiyasini ko'rsatdi, L2 bosqichining mavjudligi esa transformatsiya yo'qligini ko'rsatdi. Tasvirlar iRiS™ raqamli hujayra tasvirlash tizimi yordamida olindi. Ushbu tajriba ikki bosqichda, har biri oltita takrorlanish bilan o'tkazildi. Ikkala tajribadan olingan ma'lumotlar birlashtirildi va taqdim etildi.
5-yodoindol va avermektinning urug'larga toksikligi Murashige va Skoog agar plastinkalarida unib chiqish sinovlari yordamida baholandi.62 B. oleracea va R. raphanistrum urug'lari avval steril distillangan suvda bir kun davomida namlandi, 1 ml 100% etanol bilan yuvildi, 1 ml 50% tijorat oqartirgichi (3% natriy gipoxlorit) bilan 15 daqiqa davomida sterilizatsiya qilindi va 1 ml steril suv bilan besh marta yuvildi. Keyin sterilizatsiya qilingan urug'lar 0,86 g/l (0,2X) Murashige va Skoog muhiti va 0,7% bakteriologik agarni 5-yodoindol yoki avermektin bilan yoki qo'shmasdan o'z ichiga olgan unib chiqish agar plastinkalariga bosildi. Keyin plastinkalar 22 °C da inkubatsiya qilindi va 3 kunlik inkubatsiyadan so'ng tasvirlar olindi. Ushbu tajriba ikki bosqichda o'tkazildi, ularning har biri oltita takrorlanishdan iborat edi.
Joylashtirilgan vaqt: 2025-yil 26-fevral