Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur.Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi cheklangan CSS-ni qo'llab-quvvatlaydi.Eng yaxshi natijalarga erishish uchun brauzeringizning yangiroq versiyasidan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da Moslik rejimini o'chirib qo'ying).Ayni paytda, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslubsiz yoki JavaScriptsiz ko'rsatmoqdamiz.
Tabiiy mahsulotlarni topish va ulardan foydali foydalanish inson hayotini yaxshilashga yordam beradi.O'simliklarning o'sishini inhibe qiluvchi kimyoviy moddalar begona o'tlarni nazorat qilish uchun gerbitsidlar sifatida keng qo'llaniladi.Har xil turdagi gerbitsidlarni qo'llash zarurati tufayli yangi ta'sir mexanizmlari bo'lgan birikmalarni aniqlash zarurati tug'iladi.Ushbu tadqiqotda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan yangi N-alkoksipirol birikmasi kumamonamidni topdik va to'liq sintez jarayonini o'rnatdik.Biologik faollik tahlillari orqali biz urs-monoamik kislota urs-monoamidning sintetik oraliq mahsuloti va potentsial ekanligini aniqladik.o'simlik o'sishi inhibitori.Bundan tashqari, biz HeLa hujayralarining o'sishiga salbiy ta'sir ko'rsatmasdan, yuqori gerbitsid faolligiga ega bo'lgan urbeniloksi lotinini (UDA) o'z ichiga olgan turli xil urbenon kislota hosilalarini ishlab chiqdik.Shuningdek, biz urmotonik kislota hosilalari o'simlik mikrotubullarini buzishini aniqladik;bundan tashqari, KAND aktin filamentlariga ta'sir qiladi va hujayra o'limini keltirib chiqaradi;Ushbu ko'p qirrali ta'sirlar ma'lum mikrotubula inhibitörlerinden farq qiladi va urson kislotasi uchun yangi ta'sir mexanizmini taklif qiladi, bu yangi gerbitsidlarni ishlab chiqishda muhim afzallik hisoblanadi.
Foydali tabiiy mahsulotlar va ularning hosilalarini topish va amaliyotda qo‘llash inson hayoti sifatini oshirish vositasidir.Mikroorganizmlar, o'simliklar va hasharotlar tomonidan ishlab chiqarilgan ikkilamchi metabolitlar tibbiyot va qishloq xo'jaligida katta yutuqlarga olib keldi.Tabiiy mahsulotlardan ko'plab antibiotiklar va leykemiyaga qarshi dorilar ishlab chiqilgan.Bundan tashqari, har xil turdagipestitsidlar, qishloq xo'jaligida foydalanish uchun ushbu tabiiy mahsulotlardan fungitsidlar va gerbitsidlar olinadi.Xususan, begona o'tlarga qarshi kurashuvchi gerbitsidlar zamonaviy qishloq xo'jaligida ekinlar hosildorligini oshirishning muhim vositasi bo'lib, turli turdagi birikmalar allaqachon tijorat maqsadlarida qo'llanilmoqda.Fotosintez, aminokislotalar almashinuvi, hujayra devori sintezi, mitozni tartibga solish, fitohormon signalizatsiyasi yoki oqsil sintezi kabi o'simliklardagi bir nechta hujayra jarayonlari gerbitsidlarning odatiy maqsadlari hisoblanadi.Mikrotubulalar funktsiyasini inhibe qiluvchi birikmalar mitotik tartibga ta'sir qilish orqali o'simliklarning o'sishiga ta'sir qiluvchi keng tarqalgan gerbitsidlar sinfidir2.
Mikrotubulalar sitoskeletning tarkibiy qismlari bo'lib, eukaryotik hujayralarda keng saqlanadi.Tubulin geterodimeri a-tubulin va b-tubulindan iborat bo'lib, chiziqli mikronaychalar protofilamentlarini hosil qiladi, 13 ta protofilament silindrsimon tuzilishni hosil qiladi.Mikrotubulalar o'simlik hujayralarida ko'p rol o'ynaydi, jumladan hujayra shaklini, hujayra bo'linishini va hujayra ichidagi transportni aniqlash3,4.O'simlik hujayralarida interfazali plazma membranasi ostida mikrotubulalar mavjud va bu kortikal mikronaychalar tsellyuloza sintaza komplekslarini tartibga solish orqali tsellyuloza mikrofibrillalarining tashkil etilishini nazorat qiladi4,5.Ildiz uchining tez cho'zilishi zonasida mavjud bo'lgan ildiz epidermis hujayralarining kortikal mikronaychalari yon tomonda joylashgan va tsellyuloza mikrofiberlari bu mikronaychalarni kuzatib boradi va hujayra kengayish yo'nalishini cheklaydi va shu bilan hujayraning anizotropik cho'zilishiga yordam beradi.Shuning uchun mikronaychalar funktsiyasi o'simlik morfologiyasi bilan chambarchas bog'liq.Tubulinni kodlovchi genlarda aminokislotalarning almashinuvi kortikal mikrotubulalar massivlarining qiyshayishiga va Arabidopsis 6,7 ning chap yoki o'ng qirrali o'sishiga olib keladi.Xuddi shunday, mikronaychalar dinamikasini tartibga soluvchi mikronaychalar bilan bog'langan oqsillardagi mutatsiyalar ham ildiz o'sishining buzilishiga olib kelishi mumkin8,9,10,11,12,13.Bundan tashqari, pretilaxlor deb ham ataladigan disopiramid kabi mikrotubulani buzuvchi gerbitsidlar bilan davolash ham chap qirrali qiyshiq ildiz o'sishiga olib keladi14.Ushbu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, mikrotubulalar funktsiyasini aniq tartibga solish o'simliklarning o'sish yo'nalishini aniqlash uchun juda muhimdir.
Har xil turdagi mikrotubulalar ingibitorlari kashf etilgan va bu dorilar sitoskeletal tadqiqotlarga, shuningdek, qishloq xo'jaligi va tibbiyotga katta hissa qo'shgan2.Xususan, orzalin, dinitroanilin birikmalari, disopiramid, benzamid bilan bog'liq birikmalar va ularning analoglari mikronaychalar funktsiyasini inhibe qilishi va shu bilan o'simliklarning o'sishiga to'sqinlik qilishi mumkin.Shuning uchun ular gerbitsid sifatida keng qo'llaniladi.Biroq, mikrotubulalar o'simlik va hayvon hujayralarining muhim tarkibiy qismi bo'lganligi sababli, ko'pchilik mikrotubulalar ingibitorlari ikkala hujayra turi uchun sitotoksikdir.Shuning uchun, ularning gerbitsidlar sifatida tan olingan foydaliligiga qaramay, amaliy maqsadlarda cheklangan miqdordagi mikrotubulaga qarshi vositalar qo'llaniladi.
Streptomyces - aerob, gramm-musbat, filamentli bakteriyalarni o'z ichiga olgan Streptomyces oilasining jinsi va ikkilamchi metabolitlarning keng doirasini ishlab chiqarish qobiliyati bilan mashhur.Shuning uchun u yangi biologik faol tabiiy mahsulotlarning eng muhim manbalaridan biri hisoblanadi.Joriy tadqiqotda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 va S. werraensis ISP 5486 dan ajratilgan kumamonamid deb nomlangan yangi birikmani topdik. Spektral tahlil va toʻliq spektral tahlil yordamida kumamonamidning tuzilishi va uning noyob N-alkoksipirol skeleti tavsiflandi. belgilangan edi.sintez.Ursmonoamid va uning hosilalarining sintetik oraliq mahsuloti bo'lgan ursmon kislotasi mashhur Arabidopsis thaliana o'simlikining o'sishi va unib chiqishiga to'sqinlik qilishi aniqlandi.Tuzilish-faoliyat munosabatlarini o'rganishda biz urson kislotasining noniloksi hosilasi (KAND) deb ataladigan urson kislotasiga o'zgartirilgan C9 bilan birikma o'sish va unib chiqishga inhibitiv ta'sirni sezilarli darajada oshirishini aniqladik.Shunisi e'tiborga loyiqki, yangi kashf etilgan o'simliklar o'sishi inhibitori tamaki va jigar o'simliklarining o'sishiga ham ta'sir ko'rsatdi va bakteriyalar yoki HeLa hujayralari uchun sitotoksik emas edi.Bundan tashqari, ba'zi urmotonik kislota hosilalari buzilgan ildiz fenotipini keltirib chiqaradi, bu esa bu hosilalar to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita mikronaychalarga ta'sir qilishini anglatadi.Ushbu g'oyaga muvofiq, immunohistokimyoviy yoki lyuminestsent oqsillar bilan etiketlangan mikrotubulalar bo'yicha kuzatuvlarimiz KAND bilan davolash mikronaychalarni depolimerizatsiya qilishini ko'rsatadi.Bundan tashqari, kumamotonik kislota hosilalari bilan davolash aktin mikrofilamentlarini buzdi.Shunday qilib, biz noyob ta'sir mexanizmi sitoskeletonni yo'q qilishni o'z ichiga olgan yangi o'simlik o'sishi inhibitori topdik.
MK493-CF1 shtammi Tokioning Shinagava-ku shahrida tuproqdan ajratilgan.MK493-CF1 shtammi yaxshi tarvaqaylab ketgan stromal mitseliyni hosil qildi.16S ribosoma RNK genining qisman ketma-ketligi (1422 bp) aniqlandi.Bu shtamm S. werraensisga juda oʻxshaydi (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik shtamm, 99,93%).Ushbu natijaga asoslanib, bu shtamm S. werraensis turi shtammi bilan chambarchas bog'liqligi aniqlandi.Shuning uchun biz bu shtammni vaqtincha S. werraensis MK493-CF1 deb nomladik.S. werraensis ISP 5486T ham bir xil bioaktiv birikmalarni ishlab chiqaradi.Ushbu mikroorganizmdan tabiiy mahsulotlar olish bo'yicha dastlabki tadqiqotlar kam bo'lganligi sababli, keyingi kimyoviy tadqiqotlar olib borildi.S. werraensis MK493-CF1 arpa muhitida 30°C da 14 kun davomida qattiq holatdagi fermentatsiya yoʻli bilan oʻstirilgandan soʻng, muhit 50% EtOH bilan ekstraksiya qilindi.59,5 mg xom ekstrakti olish uchun 60 ml namuna quritildi.Xom ekstrakt N-metoksi-1H-pirol-2-karboksamidni (1, kumamonamid deb nomlangan, 36,0 mg) berish uchun teskari fazali HPLCga duchor bo'ldi.1 ning umumiy miqdori xom ekstraktning taxminan 60% ni tashkil qiladi.Shuning uchun biz kumamotoamid 1 ning xususiyatlarini batafsil o'rganishga qaror qildik.
Coumamonamide 1 oq amorf kukun va yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (HRESIMS) C6H8N2O2 ni tasdiqlaydi (1-rasm).Ushbu birikmaning C2 bilan almashtirilgan pirol fragmenti dH 6,94 (1H, t, J = 2,8, 4,8 Gts, H-4), dH 6,78 (1H, d, J = 2,5, 1H NMR spektrida DH: 4,5 Gts) bilan tavsiflanadi. , H-5) va dH 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6) va 13C NMR spektri to'rtta sp2 uglerod atomining mavjudligini ko'rsatadi.C2 pozitsiyasida amid guruhining mavjudligi C-3 protonidan amid karbonil uglerodiga DC 161.1 da HMBC korrelyatsiyasi bilan baholandi.Bundan tashqari, DH 4.10 (3H, S) va DC 68.3 da 1 H va 13 C NMR tepaliklari molekulada N-metoksi guruhlari mavjudligini ko'rsatadi.Kengaytirilgan farq spektroskopiyasi va yadroviy Overhauser qisqartmasi (NOEDF) kabi spektroskopik tahlil yordamida metoksi guruhining to'g'ri pozitsiyasi hali aniqlanmagan bo'lsa-da, N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid birinchi nomzod birikma bo'ldi.
1 ning to'g'ri tuzilishini aniqlash uchun umumiy sintez amalga oshirildi (2a-rasm).Savdoda mavjud bo'lgan 2-aminopiridin 2 ni m-CPBA bilan davolash miqdoriy hosildorlikda mos keladigan N-oksid 3 ga olib keldi.2 ning 2-aminoazidatsiyasidan so'ng, Abramovich tomonidan tasvirlangan siklokondensatsiya reaktsiyasi benzolda 90 ° C da kerakli 1-gidroksi-1H-pirol-2-karbonitril 5 grammda olib borildi.Tezlik 60% (ikki bosqich).15,16.4 ning metillanishi va gidrolizlanishi, keyin 1-metoksi-1H-pirol-2-karboksilik kislotani ("kumotonik kislota" deb ataladi), yaxshi hosil (70%, ikki bosqich) bilan berdi.Nihoyat, suvli ammiak yordamida kislota xlorid oraliq mahsuloti 6 orqali amidlanish Kumamoto amid 1 ga 98% hosil berdi.Sintezlangan 1 ning barcha spektral ma'lumotlari izolyatsiya qilingan 1 ga o'xshash edi, shuning uchun 1 ning tuzilishi aniqlandi;
Urbenamid va urben kislotasining umumiy sintezi va biologik faolligini tahlil qilish.(a) Kumamoto amidining umumiy sintezi.(b) Etti kunlik yovvoyi turdagi Arabidopsis Columbia (Col) ko'chatlari ko'rsatilgan konsentratsiyalarda kumamonamid 6 yoki kumamonamid 1 ni o'z ichiga olgan Murashige va Skoog (MS) plitalarida o'stirildi.Masshtab satri = 1 sm.
Birinchidan, biz urbenamid va uning oraliq moddalarining biologik faolligini ularning o'simliklar o'sishini modulyatsiya qilish qobiliyatini baholadik.Biz MS agar muhitiga ursmonamid 1 yoki ursmonik kislota 6 ning turli konsentratsiyasini va bu muhitda o'stirilgan Arabidopsis thaliana ko'chatlarini qo'shdik.Ushbu tahlillar 6 ning yuqori konsentratsiyasi (500 mkM) ildiz o'sishini inhibe qilishini ko'rsatdi (2b-rasm).Keyinchalik, biz 6 ning N1 pozitsiyasini almashtirish orqali turli hosilalarni yaratdik va ular bo'yicha tuzilma-faoliyat munosabatlarini o'rganishni amalga oshirdik (analog sintez jarayoni Qo'llab-quvvatlovchi ma'lumotlarda (SI) tasvirlangan).Arabidopsis ko'chatlari 50 mkM urson kislotasi hosilalarini o'z ichiga olgan muhitda o'stirildi va ildiz uzunligi o'lchandi.rasmda ko'rsatilganidek.3a, b va S1-rasmlarda ko'rsatilganidek, kumamo kislotalari N1 holatida turli uzunlikdagi chiziqli alkoksi zanjirlariga (9, 10, 11, 12 va 13) yoki yirik alkoksi zanjirlariga (15, 16 va 17) ega.Losmalar ildiz o'sishini sezilarli darajada inhibe qildi.Bundan tashqari, biz 200 mkM 10, 11 yoki 17 qo'llanilishi unib chiqishini inhibe qilishini aniqladik (3c va S2-rasm).
Kumamoto amid va tegishli birikmalarning struktura-faol munosabatlarini o'rganish.(a) Analoglarning tuzilishi va sintez sxemasi.(b) MS muhitida 50 mkM kumamonamid hosilalari bilan yoki ularsiz o'stirilgan 7 kunlik ko'chatlarning ildiz uzunligi miqdorini aniqlash.Yulduzchalar soxta davolash bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t testi, p< 0,05).n>18. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan.nt "sinovdan o'tmagan" degan ma'noni anglatadi, chunki urug'larning 50% dan ortig'i unib chiqmagan.(c) 7 kun davomida MS muhitida 200 mkM kumamonamid va tegishli birikmalarsiz inkubatsiya qilingan ishlov berilgan urug'larning unib chiqish tezligini aniqlash.Yulduzchalar soxta davolash (chi-kvadrat testi) bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi.n=96.
Qizig'i shundaki, C9 dan uzunroq alkil yon zanjirlarining qo'shilishi inhibitiv faollikni pasaytirdi, bu kumamotoik kislota bilan bog'liq birikmalar biologik faolligini ko'rsatish uchun ma'lum o'lchamdagi yon zanjirlarni talab qiladi.
Tuzilish-faoliyat munosabatlari tahlili shuni ko'rsatdiki, C9 urson kislotasiga o'zgartirilgan va urson kislotasining noniloksi hosilasi (keyingi o'rinlarda KAND 11 deb yuritiladi) o'simliklarning eng samarali o'sishi inhibitori bo'lgan, biz KAND 11 ning batafsil tavsifini o'tkazdik. Arabidopsisni davolash 50 mkM KAND 11 bilan deyarli butunlay unib chiqishni oldini oldi, KAND 11 ning past konsentratsiyasi (40, 30, 20 yoki 10 mkM) dozaga bog'liq holda ildiz o'sishini inhibe qildi (4a, b-rasm).KAND 11 ildiz meristema hayotiyligiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz propidiy yodid (PI) bilan bo'yalgan ildiz meristemalarini ko'rib chiqdik va meristema maydoni hajmini o'lchadik.Tarkibida 25 mkM KAND-11 bo‘lgan muhitda yetishtirilgan ko‘chatlar meristemasining o‘lchami 151,1 ± 32,5 mkm, DMSO li nazorat muhitida yetishtirilgan ko‘chatlar meristemasining o‘lchami esa 264,7 ± 30,8 mkm (4c, d-rasm) , bu KAND-11 ning hujayra faoliyatini tiklashini ko'rsatadi.tarqalish.Ildiz meristema.Shunga mos ravishda, KAND 11 bilan davolash ildiz meristemasida hujayra bo'linish belgisi CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS signali miqdorini kamaytirdi (4e-rasm) 17.Ushbu natijalar KAND 11 hujayra proliferatsiyasi faolligini kamaytirish orqali ildiz o'sishini inhibe qilishini ko'rsatadi.
Urbenon kislota hosilalarining (urbeniloksi lotinlari) o'sishga inhibitiv ta'sirini tahlil qilish.(a) KAND 11 ning ko'rsatilgan konsentratsiyasi bilan MS plitalarida o'stirilgan 7 kunlik yovvoyi turdagi Col ko'chatlari. Masshtab chizig'i = 1 sm.(b) ildiz uzunligini miqdoriy aniqlash.Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p< 0,05).n>16. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan.(c) MS plitalarida 25 mkM KAND bo'lgan yoki bo'lmasdan o'stirilgan propidiy yodid bilan bo'yalgan yovvoyi turdagi Col ildizlarining konfokal mikroskopiyasi 11. Oq qavslar ildiz meristemasini ko'rsatadi.O'lchov paneli = 100 mikron.(d) Ildiz meristema hajmini aniqlash (n = 10 dan 11 gacha).Statistik farqlar t-test yordamida aniqlandi (p< 0,05).Chiziqlar o'rtacha meristema hajmini ifodalaydi.(e) CDKB2 konstruktsiyasini o'z ichiga olgan ildiz meristemasining differentsial interferentsiyali kontrastli (DIC) mikroskopiyasi;1pro: CDKB2;1-GUS bo'yalgan va 25 µM KAND tahlili bilan yoki bo'lmagan MS plitalarida o'stirilgan 5 kunlik ko'chatlarda bo'yalgan.
KAND 11 ning fitotoksisitesi yana bir ikki pallali o'simlik, tamaki (Nicotiana tabacum) va asosiy quruqlikdagi o'simlik organizmi, jigar o'ti (Marchantia polymorpha) yordamida sinovdan o'tkazildi.Arabidopsisda bo'lgani kabi, tarkibida 25 mkM KAND 11 bo'lgan muhitda o'stirilgan tamaki SR-1 ko'chatlari qisqaroq ildiz hosil qilgan (5a-rasm).Bundan tashqari, 48 ta urug'dan 40 tasi 200 mkM KAND 11 ni o'z ichiga olgan plastinkalarda unib chiqdi, holbuki barcha 48 ta urug'lar soxtalashtirilgan muhitda unib chiqdi, bu esa KANDning yuqori konsentratsiyasi sezilarli bo'lganligini ko'rsatadi (p).< 0,05;chi testi -kvadrat) tamaki unib chiqishini inhibe qilgan.(5b-rasm).Bundan tashqari, jigar o'tida bakteriyalar o'sishini inhibe qilgan KAND 11 kontsentratsiyasi Arabidopsisdagi samarali konsentratsiyaga o'xshash edi (5c-rasm).Ushbu natijalar KAND 11 turli o'simliklarning o'sishiga to'sqinlik qilishi mumkinligini ko'rsatadi.Keyin biz boshqa organizmlardagi ayiq monoamid bilan bog'liq birikmalarning mumkin bo'lgan sitotoksikligini, xususan, insonning HeLa hujayralari va Escherichia coli shtammi DH5a, mos ravishda yuqori hayvon va bakterial hujayralar vakillari sifatida tekshirdik.Hujayra ko'payish tahlillari seriyasida biz kumamonamid 1, kumamonamid kislotasi 6 va KAND 11 100 mkM konsentratsiyalarda HeLa yoki E. coli hujayralarining o'sishiga ta'sir qilmasligini kuzatdik (5d, e-rasm).
Arabidopsis bo'lmagan organizmlarda KAND 11 o'sishini inhibe qilish.(a) Ikki haftalik yovvoyi turdagi SR-1 tamaki ko‘chatlari 25 mkM KAND 11 ni o‘z ichiga olgan vertikal joylashtirilgan MS plitalarida o‘stirildi. (b) Ikki haftalik yovvoyi SR-1 tamaki ko‘chatlari gorizontal holatda o‘stirildi. 200 mkM KAND 11 ni o'z ichiga olgan MS plitalari. (c) Gamborg B5 plitalarida o'stirilgan ikki haftalik yovvoyi turdagi Tak-1 jigar kurtaklari KAND 11 ko'rsatilgan konsentratsiyalari. Qizil o'qlar ikki haftalik inkubatsiyada o'sishni to'xtatgan sporalarni ko'rsatadi. davr.(d) HeLa hujayralarining hujayra proliferatsiyasi tahlili.Hayotiy hujayralar soni ma'lum vaqt oralig'ida hujayralarni hisoblash to'plami 8 (Dojindo) yordamida o'lchandi.Nazorat sifatida, HeLa hujayralari RNK polimeraza transkripsiyasini inhibe qiluvchi va hujayra o'limiga olib keladigan 5 mkg / ml aktinomitsin D (Act D) bilan ishlov berildi.Tahlillar uch nusxada amalga oshirildi.(e) E. coli hujayralarining ko'payishi tahlili.E. coli o'sishi OD600 o'lchovi bilan tahlil qilindi.Nazorat sifatida hujayralar bakterial hujayra devori sintezini inhibe qiluvchi 50 mkg/ml ampitsillin (Amp) bilan ishlov berildi.Tahlillar uch nusxada amalga oshirildi.
Uramid bilan bog'liq birikmalar keltirib chiqaradigan sitotoksik ta'sir mexanizmini ochish uchun biz o'rtacha inhibitiv ta'sirga ega urben kislotasi hosilalarini qayta tahlil qildik.rasmda ko'rsatilganidek.2b, 6a-rasmlarda ko'rsatilganidek, yuqori konsentratsiyali (200 mkM) urmotonik kislota 6 bo'lgan agar plastinkalarida o'stirilgan ko'chatlar qisqaroq va chapga egilgan ildizlarni (th = - 23,7 ± 6,1) hosil qilgan, nazorat muhitida o'stirilgan ko'chatlarda esa ko'chatlar deyarli to'g'ri ildiz hosil qildi (th = - 3,8 ± 7,1).Bu xarakterli qiya o'sish kortikal mikronaychalarning disfunktsiyasidan kelib chiqqanligi ma'lum14,18.Ushbu topilmaga muvofiq, mikrotubulani beqarorlashtiruvchi dorilar disopiramid va orzalin bizning o'sish sharoitimizda shunga o'xshash ildiz egilishini keltirib chiqardi (2b, 6a-rasm).Shu bilan birga, biz urmotonik kislota hosilalarini sinovdan o'tkazdik va ulardan bir nechtasini tanladik, ular ma'lum kontsentratsiyalarda ildiz o'sishiga olib keldi.8, 9 va 15 birikmalar ildiz o'sishi yo'nalishini mos ravishda 75 mkM, 50 mkM va 40 mkM da o'zgartirdi, bu esa bu birikmalar mikrotubullarni samarali ravishda beqarorlashtirishi mumkinligini ko'rsatdi (2b, 6a-rasm).Shuningdek, biz eng kuchli ursolat kislota hosilasi KAND 11 ni pastroq konsentratsiyada (15 mkM) sinab ko'rdik va KAND 11 qo'llanilishi ildiz o'sishini inhibe qilishini va ildiz o'sishi yo'nalishi notekis ekanligini aniqladik, garchi ular chapga egilishga moyil bo'lsa ham ( C3-rasm)..Mikrotubulani beqarorlashtiruvchi dorilarning yuqori konsentratsiyasi ba'zan ildizlarning egilishiga olib kelishidan ko'ra o'simliklarning o'sishiga to'sqinlik qilganligi sababli, biz KAND 11 ildiz epidermal hujayralarida kortikal mikronaychalarni kuzatish orqali mikronaychalarga ta'sir qilish imkoniyatini baholadik.25 mkM KAND 11 bilan ishlov berilgan ko'chat ildizlarining epidermal hujayralarida anti-b-tubulin antikorlarini qo'llagan immunogistokimyo cho'zilish zonasida epidermal hujayralardagi deyarli barcha kortikal mikronaychalarning yo'qolishini ko'rsatdi (6b-rasm).Ushbu natijalar kumamotonik kislota va uning hosilalari mikrotubulalar ustida to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita ta'sir qilib, ularni buzishini va bu birikmalar yangi mikrotubula ingibitorlari ekanligini ko'rsatadi.
Urson kislotasi va uning hosilalari Arabidopsis thalianadagi kortikal mikrotubullarni o'zgartiradi.(a) Ko'rsatilgan konsentratsiyalarda turli xil urmotonik kislota hosilalari mavjudligida o'lchanadigan ildizning moyillik burchagi.Mikrotubullarni inhibe qilish uchun ma'lum bo'lgan ikkita birikmaning ta'siri ham tahlil qilindi: disopiramid va orzalin.Qo'shimchada ildiz o'sish burchagini o'lchash uchun ishlatiladigan standart ko'rsatilgan.Yulduzchalar soxta davolash bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t testi, p< 0,05).n>19. Masshtab satri = 1 sm.(b) cho'zilish zonasidagi epidermal hujayralardagi kortikal mikronaychalar.25 mkM KAND 11 bo'lgan yoki bo'lmagan MS plitalarida o'stirilgan yovvoyi turdagi Arabidopsis Col ildizlaridagi mikrotubulalar b-tubulin birlamchi antikorlari va Alexa Fluor bilan konjugatsiyalangan ikkilamchi antikorlar yordamida immunohistokimyoviy bo'yash orqali ko'rsatildi.O'lchov paneli = 10 mikron.v) Ildiz meristemadagi mikronaychalarning mitotik tuzilishi.Mikrotubulalar immunohistokimyoviy bo'yash yordamida ingl.Mitotik tuzilmalar, jumladan profilaktika zonalari, shpindellar va fragmoplastlar konfokal tasvirlardan hisoblangan.Oklar mitotik mikrotubula tuzilmalarini ko'rsatadi.Yulduzchalar soxta davolash bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t testi, p< 0,05).n>9. Masshtab satri = 50 mkm.
Ursa mikrotubulalar funktsiyasini buzish qobiliyatiga ega bo'lsa-da, uning ta'sir qilish mexanizmi odatdagi mikronaychalarni depolimerizatsiya qiluvchi vositalardan farq qilishi kutilmoqda.Masalan, disopiramid va orzalin kabi mikrotubulani depolimerizatsiya qiluvchi moddalarning yuqori konsentratsiyasi epidermal hujayralarning anizotropik kengayishini keltirib chiqaradi, KAND 11 esa bunday qilmaydi.Bundan tashqari, KAND 11 va disopiramidni birgalikda qo'llash disopiramid tomonidan qo'zg'atilgan ildiz o'sishi reaktsiyasiga olib keldi va KAND 11 tomonidan induktsiyalangan o'sish inhibisyonu kuzatildi (S4-rasm).Biz, shuningdek, yuqori sezgir disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantining KAND 11 ga javobini tahlil qildik. phs1-1 kanonik bo'lmagan tubulin kinaz nuqtasi mutatsiyasiga ega va disopiramid bilan davolashda qisqaroq ildiz hosil qiladi9,20.KAND 11 ni o'z ichiga olgan agar muhitida yetishtirilgan phs1-1 mutant ko'chatlari disopiramidda o'stirilganlarga o'xshash qisqaroq ildizlarga ega edi (S5-rasm).
Bundan tashqari, biz KAND 11 bilan ishlov berilgan ko'chatlarning ildiz meristemasida profaza zonalari, shpindellar va fragmoplastlar kabi mitotik mikrotubulalar tuzilmalarini kuzatdik. mitotik mikronaychalar soni kuzatildi (6c-rasm).
KAND 11 ning hujayra osti rezolyutsiyasida sitotoksikligini tavsiflash uchun biz tamaki BY-2 suspenziya hujayralarini KAND 11 bilan davolashdik va ularning javobini kuzatdik.KAND 11 ning kortikal mikronaychalarga ta'sirini baholash uchun birinchi navbatda mikrotubulalar yorliqlarini lyuminestsent tarzda belgilaydigan TagRFP-TUA6 ifodalovchi BY-2 hujayralariga KAND 11 ni qo'shdik.Kortikal mikrotubulaning zichligi tasvir tahlili yordamida baholandi, bu sitoplazmatik piksellar orasidagi sitoskeletal piksellarning foizini aniqladi.Tahlil natijalari shuni ko'rsatdiki, 1 soat davomida 50 mkM yoki 100 mkM KAND 11 bilan ishlov berilgandan so'ng, zichlik mos ravishda 0,94 ± 0,74% yoki 0,23 ± 0,28% gacha sezilarli darajada kamaydi, DMSO bilan ishlov berilgan hujayralar zichligi esa ± 10,61 ni tashkil etdi. % (7a-rasm).Bu natijalar Arabidopsisda KAND 11 bilan davolash kortikal mikronaychalarning depolimerizatsiyasini keltirib chiqarishi haqidagi kuzatuvga mos keladi (6b-rasm).Shuningdek, biz KAND 11 ning bir xil konsentratsiyasi bilan ishlov berilgandan so'ng GFP-ABD etiketli aktin filamentlari bilan BY-2 chizig'ini ko'rib chiqdik va KAND 11 bilan ishlov berish aktin filamentlarini buzganligini kuzatdik.1 soat davomida 50 mkM yoki 100 mkM KAND 11 bilan davolash aktin filament zichligini mos ravishda 1,20 ± 0,62% yoki 0,61 ± 0,26% ga sezilarli darajada kamaytirdi, holbuki DMSO bilan ishlov berilgan hujayralardagi zichlik 1,69 ± 0,2% ni tashkil etdi.7b).Ushbu natijalar aktin filamentlariga ta'sir qilmaydigan propizamid va mikronaychalarga ta'sir qilmaydigan aktin depolimerizatori latrunkulin B ta'siridan farq qiladi (SI Shakl S6).Bundan tashqari, kumamonamid 1, kumamonamid kislotasi 6 yoki KAND 11 bilan davolash HeLa hujayralaridagi mikronaychalarga ta'sir qilmadi (SI-rasm S7).Shunday qilib, KAND 11 ta'sir mexanizmi ma'lum bo'lgan sitoskeleton buzuvchilaridan farq qiladi, deb ishoniladi.Bundan tashqari, KAND 11 bilan davolash qilingan BY-2 hujayralarini mikroskopik kuzatishimiz KAND 11 bilan davolash paytida hujayra o'limining boshlanishini aniqladi va Evans ko'k rangga bo'yalgan o'lik hujayralar ulushi KAND 11 bilan davolashdan 30 minut keyin sezilarli darajada oshmaganligini ko'rsatdi. 50 mkM yoki 100 mkM KAND bilan 90 daqiqa davolashdan so'ng, o'lik hujayralar soni mos ravishda 43,7% yoki 80,1% gacha ko'tarildi (7c-rasm).Birgalikda bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, yangi ursolik kislota hosilasi KAND 11 ilgari noma'lum bo'lgan ta'sir mexanizmiga ega bo'lgan o'simlikka xos sitoskeletal ingibitordir.
KAND kortikal mikrotubulalar, aktin filamentlari va tamaki BY-2 hujayralarining hayotiyligiga ta'sir qiladi.(a) TagRFP-TUA6 mavjudligida BY-2 hujayralarida kortikal mikrotubulalar vizualizatsiyasi.KAND 11 (50 mkM yoki 100 mkM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari konfokal mikroskopiya bilan tekshirildi.Kortikal mikrotubula zichligi 25 ta mustaqil hujayradan iborat mikrografiyalardan hisoblab chiqilgan.Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p< 0,05).O'lchov paneli = 10 mikron.(b) BY-2 hujayralaridagi kortikal aktin filamentlari GFP-ABD2 ishtirokida ko'rsatilgan.KAND 11 (50 mkM yoki 100 mkM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari konfokal mikroskopiya bilan tekshirildi.Kortikal aktin filamentlarining zichligi 25 ta mustaqil hujayraning mikrografiyasidan hisoblab chiqilgan.Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p< 0,05).O'lchov paneli = 10 mikron.(c) Evans ko'k bo'yash orqali o'lik BY-2 hujayralarini kuzatish.KAND 11 (50 mkM yoki 100 mM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari yorqin maydon mikroskopiyasi bilan tekshirildi.n=3.O'lchov paneli = 100 mikron.
Yangi tabiiy mahsulotlarning kashf etilishi va qo‘llanilishi inson hayotining turli jabhalarida, jumladan, tibbiyot va qishloq xo‘jaligida sezilarli yutuqlarga erishdi.Tabiiy resurslardan foydali birikmalar olish uchun tarixiy tadqiqotlar olib borildi.Xususan, aktinomitsetalar nematodalar uchun antiparazitik antibiotiklar sifatida foydali ekanligi ma'lum, chunki ular turli xil ikkilamchi metabolitlarni, masalan, ivermektin va bleomitsinning qo'rg'oshin birikmasi bo'lgan avermektin va uning hosilalari ishlab chiqarish qobiliyatiga ega, ular tibbiyotda saratonga qarshi vosita sifatida ishlatiladi21,22.Xuddi shunday, aktinomitsetlardan turli xil gerbitsid birikmalari topilgan, ularning ba'zilari allaqachon tijoratda qo'llaniladi1,23.Shuning uchun, kerakli biologik faollikka ega tabiiy mahsulotlarni ajratib olish uchun aktinomitset metabolitlarini tahlil qilish samarali strategiya hisoblanadi.Ushbu tadqiqotda biz S. werraensisdan yangi birikma - kumamonamidni topdik va uni muvaffaqiyatli sintez qildik.Urson kislotasi urbenamid va uning hosilalarining sintetik oraliq mahsulotidir.Bu xarakterli ildizlarning burishishiga olib kelishi, o'rtacha va kuchli gerbitsid faolligini ko'rsatishi va o'simlik mikronaychalariga bevosita yoki bilvosita zarar etkazishi mumkin.Shu bilan birga, urmotonik kislotaning ta'sir qilish mexanizmi mavjud mikronaychalar inhibitörlerinden farq qilishi mumkin, chunki KAND 11 ham aktin filamentlarini buzadi va hujayra o'limiga sabab bo'ladi, bu urmotonik kislota va uning hosilalari sitoskeletal tuzilmalarning keng doirasiga ta'sir qiladigan tartibga solish mexanizmini taklif qiladi..
Urbenon kislotasining yanada batafsil tavsifi urbenon kislotasining ta'sir mexanizmini yaxshiroq tushunishga yordam beradi.Xususan, keyingi maqsad - urson kislotasining qisqargan mikronaychalar bilan bog'lanish qobiliyatini baholash, urson kislotasi va uning hosilalari to'g'ridan-to'g'ri mikronaychalarga ta'sir qiladimi va ularni depolimerizatsiya qiladimi yoki ularning ta'siri natijasida mikronaychalarning beqarorligiga olib keladimi.Bundan tashqari, agar mikrotubulalar to'g'ridan-to'g'ri nishon bo'lmasa, urson kislotasining o'simlik hujayralariga ta'sir qilish joyini va molekulyar maqsadlarini aniqlash tegishli birikmalarning xususiyatlarini va gerbitsid faolligini yaxshilashning mumkin bo'lgan usullarini tushunishga yordam beradi.Bizning bioaktivlik tahlilimiz urson kislotasining Arabidopsis thaliana, tamaki va jigar o'ti kabi o'simliklarning o'sishiga noyob sitotoksik qobiliyatini aniqladi, shu bilan birga na E. coli, na HeLa hujayralari ta'sir ko'rsatmadi.Ochiq qishloq xo'jaligi dalalarida foydalanish uchun gerbitsidlar sifatida ishlab chiqilgan bo'lsa, urson kislotasi hosilalarining afzalligi hayvon hujayralariga juda kam yoki umuman toksik ta'sir ko'rsatmaydi.Haqiqatan ham, mikrotubulalar eukariotlarda keng tarqalgan tuzilmalar bo'lganligi sababli, ularning o'simliklarda selektiv inhibisyoni gerbitsidlar uchun asosiy talabdir.Masalan, tubulin bilan bevosita bog‘lanib, polimerlanishni inhibe qiluvchi mikronaychali depolimerizatsiya qiluvchi propizamid hayvon hujayralariga nisbatan past toksikligi tufayli gerbitsid sifatida ishlatiladi24.Disopiramiddan farqli o'laroq, tegishli benzamidlar turli maqsadli o'ziga xos xususiyatlarga ega.O'simlik mikronaychalaridan tashqari, RH-4032 yoki benzoksamid ham mos ravishda hayvon hujayralari yoki oomisetlarning mikronaychalarini inhibe qiladi va zalilamid past fitotoksisitesi tufayli fungitsid sifatida ishlatiladi25,26,27.Yangi kashf etilgan ayiq va uning hosilalari o'simliklarga qarshi selektiv sitotoksiklikni namoyish etadi, ammo shuni ta'kidlash kerakki, keyingi modifikatsiyalar ularning maqsadli o'ziga xosligini o'zgartirishi mumkin, bu patogen zamburug'lar yoki oomisetlarni nazorat qilish uchun qo'shimcha hosilalarni ta'minlaydi.
Urbenon kislotasi va uning hosilalarining noyob xususiyatlari ularni gerbitsidlar sifatida ishlab chiqish va tadqiqot vositalari sifatida foydalanish uchun foydalidir.O'simlik hujayrasi shaklini boshqarishda sitoskeletning ahamiyati keng e'tirof etilgan.Ilgari olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, o'simliklar morfogenezni to'g'ri nazorat qilish uchun mikrotubula dinamikasini nazorat qilish orqali kortikal mikrotubulalar tashkil etilishining murakkab mexanizmlarini ishlab chiqdi.Mikrotubulalar faoliyatini tartibga solish uchun mas'ul bo'lgan ko'plab molekulalar aniqlangan va ular bilan bog'liq tadqiqotlar hali ham davom etmoqda3,4,28.O'simlik hujayralarida mikrotubulalar dinamikasi haqidagi hozirgi tushunchamiz kortikal mikrotubulalar tashkil etish mexanizmlarini to'liq tushuntirmaydi.Masalan, disopiramid ham, orzalin ham mikronaychalarni depolimerizatsiyalashi mumkin bo'lsa-da, disopiramid kuchli ildiz buzilishiga olib keladi, orizalin esa nisbatan yumshoq ta'sirga ega.Bundan tashqari, mikronaychalarni barqarorlashtiradigan tubulin mutatsiyalari ham ildizlarda dekstrorotatsiyaga olib keladi, mikrotubulalar dinamikasini barqarorlashtiradigan paklitaksel esa bunday qilmaydi.Shuning uchun ursolik kislotaning molekulyar maqsadlarini o'rganish va aniqlash o'simlik kortikal mikrotubulalari tartibga solinishi bo'yicha yangi tushunchalarni berishi kerak.Xuddi shunday, disopiramid kabi buzilgan o'sishni rag'batlantirishda samarali bo'lgan kimyoviy moddalar va orzalin yoki kumamotor kislotasi kabi kamroq samarali kimyoviy moddalarni kelajakda taqqoslash buzilgan o'sish qanday sodir bo'lishi haqida maslahat beradi.
Boshqa tomondan, mudofaa bilan bog'liq sitoskeletal o'zgarishlar urson kislotasining sitotoksikligini tushuntirishning yana bir imkoniyatidir.Patogenning infektsiyasi yoki o'simlik hujayralariga elisitorning kiritilishi ba'zan sitoskeletonning yo'q qilinishiga va keyinchalik hujayra o'limiga olib keladi29.Misol uchun, oomisetlardan olingan kriptoksantin tamaki hujayralari o'lishidan oldin mikrotubulalar va aktin filamentlarini buzishi haqida xabar berilgan, bu KAND bilan davolashda sodir bo'ladigan narsaga o'xshaydi30,31.Himoya reaktsiyalari va urson kislotasi tomonidan qo'zg'atilgan hujayrali javoblar o'rtasidagi o'xshashlik bizni ular umumiy hujayra jarayonlarini qo'zg'atadi, deb taxmin qilishga olib keldi, garchi urson kislotasining kriptoksantinga qaraganda tezroq va kuchli ta'siri aniq.Biroq, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, aktin filamentlarining buzilishi hujayralarning o'z-o'zidan o'limiga yordam beradi, bu har doim ham mikronaychalarning buzilishi bilan birga kelmaydi29.Bundan tashqari, patogen yoki elisitor urson kislotasi hosilalari kabi buzilgan ildiz o'sishiga olib keladimi yoki yo'qligini aniqlash kerak.Shunday qilib, mudofaa reaktsiyalari va sitoskeletonni bog'laydigan molekulyar bilim - hal qilinishi kerak bo'lgan jozibali muammo.Urson kislotasi bilan bog'liq past molekulyar og'irlikdagi birikmalar, shuningdek, turli xil quvvatga ega bo'lgan lotinlar mavjudligidan foydalanib, ular noma'lum hujayra mexanizmlarini nishonga olish imkoniyatini berishi mumkin.
Birgalikda, mikrotubulalar dinamikasini modulyatsiya qiluvchi yangi birikmalarning topilishi va qo'llanilishi o'simlik hujayralari shaklini aniqlashning murakkab molekulyar mexanizmlarini hal qilishning kuchli usullarini beradi.Shu nuqtai nazardan, mikronaychalar va aktin filamentlariga ta'sir qiluvchi va hujayra o'limini keltirib chiqaradigan yaqinda ishlab chiqilgan urmotonik kislota birikmasi mikrotubulalar nazorati va boshqa mexanizmlar o'rtasidagi aloqani ochish imkoniyatini berishi mumkin.Shunday qilib, urbenon kislotasi yordamida kimyoviy va biologik tahlil o'simlik sitoskeletini boshqaradigan molekulyar tartibga solish mexanizmlarini tushunishga yordam beradi.
S. werraensis MK493-CF1 ni 2% (h/h) galaktoza, 2% (h/h) essensiya pastasi, 1% (h/h) Bakto tarkibidan tashkil topgan 110 ml urug‘ muhiti bo‘lgan 500 ml hajmli erlenmeyer kolbasiga soling. .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) makkajo'xori ekstrakti (KOGOSTCH Co., Ltd., Yaponiya), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 va 0,2% CaCO3 deionlangan suvda.(sterilizatsiyadan oldin pH 7,4).Urug'lik ekinlari 2 kun davomida 27 ° C da aylanadigan chayqagichda (180 rpm) inkubatsiya qilindi.Qattiq holatdagi fermentatsiya orqali ishlab chiqarish.Urug'lik madaniyati (7 ml) 15 g presslangan arpa (MUSO Co., Ltd., Yaponiya) va 25 g deionizatsiyalangan suvdan (pH sozlanmagan) 40 g ishlab chiqarish muhiti bo'lgan 500 ml K-1 kolbaga o'tkazildi. sterilizatsiya qilishdan oldin).).Fermentatsiya 30 ° C haroratda 14 kun davomida qorong'i joyda o'tkazildi.Fermentatsiya moddasi 40 ml / shisha EtOH bilan ekstraksiya qilingan va santrifüj qilingan (1500 g, 4 ° C, 10 min).Madaniyat supernatanti (60 ml) 10% MeOH/EtOAc aralashmasi bilan ekstraksiya qilindi.Organik qatlam qoldiqni (59,5 mg) olish uchun pasaytirilgan bosim ostida bug'landi, u teskari fazali ustunda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 mkm, ID) gradient elyusiyasi (0-10 daqiqa: 90%) bilan HPLC ta'siridan o'tkazildi. 10 mm × uzunlik 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 daqiqa: 90% H2O/CH3CN dan 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 daqiqa: 90% H2O/EtOH, 45–155 daqiqa: 90% H2O / EtOH dan 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) 1,5 ml / min oqim tezligida, kumamonamid (1, 36,0 mg) oq amorf kukun sifatida ajratilgan.
Kumamotoamid (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) d 6,93 (t, J = 2,5 Hz, 1H), 6,76 (dd, J = 4,3, 1,8 Hz 1H), 6,05 (t, J = 3,8 Hz, 1H).), 4,08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) d 161,1, 121,0, 119,9, 112,2, 105,0, 68,3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hisoblangan qiymat: 141.0659, oʻlchov qiymati: 141.0663, IR nmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593–113.
Kolumbiya urug'lari (Col-0) Arabidopsis Biologik Resurs Markazidan (ABRC) tadqiqotdan foydalanish uchun ruxsatnoma bilan olingan.Col-0 urug'lari bizning laboratoriya sharoitlarida ko'paytirildi va saqlangan va yovvoyi turdagi Arabidopsis o'simliklari sifatida ishlatilgan.Arabidopsis urug'lari sirt sterilizatsiya qilindi va 2% saxaroza (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino) etansulfonik kislota (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) bo'lgan yarim quvvatli Murashige va Skoog muhitida o'stirildi. ).) va 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5,7, 23 °C va doimiy yorug'likda.Phs1-1 mutantining urug'lari T. Xashimoto (Nara Fan va Texnologiya Instituti) tomonidan taqdim etilgan.
SR-1 shtammining urug'lari T. Xashimoto (Nara Fan va Texnologiya Instituti) tomonidan taqdim etilgan va yovvoyi tamaki o'simliklari sifatida ishlatilgan.Tamaki urug'lari unib chiqishini ta'minlash uchun sirt sterilizatsiya qilingan va steril suvda uch kecha davomida namlangan, so'ngra 2% saxaroza, 0,05% (h/v) MES va 0,8% gellan saqich (Fujifilm Wako Pure Chemical) o'z ichiga olgan yarim quvvatli eritma ichiga joylashtirilgan. Murashige.va Skoog muhiti) pH 5,7 bo'lgan va doimiy yorug'lik ostida 23 ° C da inkubatsiya qilingan.
Tak-1 shtammi T. Koxchi (Kyoto universiteti) tomonidan taqdim etilgan va jigar o'tlarini o'rganish uchun standart eksperimental birlik sifatida ishlatilgan.Gemma sterillangan madaniyatli o'simliklardan olingan va keyin 1% saxaroza va 0,3% gellan saqichini o'z ichiga olgan Gamborg B5 muhitiga (Fujifilm Wako Pure Chemical) qo'yilgan va doimiy yorug'lik ostida 23 ° C da inkubatsiya qilingan.
Tamaki BY-2 hujayralari (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokio universiteti) tomonidan taqdim etilgan.BY-2 hujayralari o'zgartirilgan Linsmeier va Skoog muhitida 95 marta suyultirildi va har hafta 2,4-diklorofenoksiasetik kislota 32 bilan to'ldiriladi.Hujayra suspenziyasi zulmatda 27 ° C da 130 rpm tezlikda aylanadigan silkitgichda aralashtiriladi.Hujayralarni 10 baravar katta hajmdagi yangi muhit bilan yuving va xuddi shu muhitda qayta suspenziya qiling.TagRFP-TUA6 mikrotubula belgisini yoki gulkaram mozaik virusi 35S promouteri ostida aktin filament belgisi GFP-ABD2 ni barqaror ifodalovchi BY-2 transgenik hujayra chiziqlari tasvirlanganidek yaratildi33,34,35.Ushbu hujayra liniyalari asl BY-2 hujayra liniyasi uchun ishlatiladiganlarga o'xshash protseduralar yordamida saqlanishi va sinxronlashtirilishi mumkin.
HeLa hujayralari Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle muhitida (DMEM) (Life Technologies) 10% homila sigir zardobida, 1,2 U/ml penitsillin va 1,2 mkg/ml streptomitsin bilan 37°C inkubatorda 5% CO2 bilan yetishtirildi.
Ushbu qo'lyozmada tasvirlangan barcha tajribalar Yaponiyaning bioxavfsizlik qoidalari va ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.
Aralashmalar dimetil sulfoksidda (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) birja eritmalari sifatida eritildi va Arabidopsis va tamaki uchun MS muhitida yoki jigar o'ti uchun Gamborg B5 muhitida suyultirildi.Ildiz o'sishini inhibe qilish tahlili uchun har bir plastinkaga 10 dan ortiq urug' ko'rsatilgan birikmalar yoki DMSO ni o'z ichiga olgan agar muhitiga ekilgan.Urug'lar 7 kun davomida o'sish kamerasida inkubatsiya qilinadi.Ko'chatlar suratga olindi va ildizlarning uzunligi o'lchandi.Arabidopsis o'sishi tahlili uchun 200 mkM birikma yoki DMSO o'z ichiga olgan agar muhitiga har bir plastinkaga 48 urug' ekilgan.Arabidopsis urug'lari o'sish kamerasida o'stiriladi va unib chiqqan ko'chatlar soni unib chiqqandan 7 kun o'tgach hisoblanadi (dag).Tamaki unib chiqishini tahlil qilish uchun, 200 mkM KAND yoki DMSO o'z ichiga olgan agar muhitiga har bir plastinkaga 24 urug' ekilgan.Tamaki urug'lari o'sish kamerasida o'stirildi va 14 kundan keyin unib chiqqan ko'chatlar soni hisoblandi.Jigar o'ti o'sishini inhibe qilish tahlili uchun har bir plastinkadan 9 ta embrion ko'rsatilgan KAND yoki DMSO kontsentratsiyasini o'z ichiga olgan agar muhitiga qo'yildi va 14 kun davomida o'sish kamerasida inkubatsiya qilindi.
Ildiz meristem tashkilotini tasavvur qilish uchun 5 mg/ml propidiy yodid (PI) bilan bo'yalgan ko'chatlardan foydalaning.PI signallari TCS SPE konfokal lazerli skanerlash mikroskopi (Leica Microsystems) yordamida floresan mikroskop yordamida kuzatildi.
Ildizlarni b-glyukuronidaza (GUS) bilan gistokimyoviy bo'yash Malami va Benfey36 tomonidan tasvirlangan protokolga muvofiq amalga oshirildi.Ko'chatlar bir kechada 90% asetonda o'rnatildi, 1 soat davomida GUS buferida 0,5 mg / ml 5-bromo-4-xloro-3-indolil-b-d-glyukuron kislotasi bilan bo'yaldi va gidratlangan xloraldegid eritmasiga joylashtirildi.(8 g xloralgidrat, 2 ml suv va 1 ml glitserin) va Axio Imager M1 mikroskopi (Carl Zeiss) yordamida differentsial interferentsiyali kontrastli mikroskop yordamida kuzatiladi.
Ildiz burchaklari vertikal ravishda joylashtirilgan plitalarda o'stirilgan 7 kunlik ko'chatlarda o'lchandi.6-bosqichda ta'riflanganidek, tortishish vektori yo'nalishidan ildizning burchagini o'lchang.
Kortikal mikrotubullarning joylashuvi bayon qilinganidek, 37-sonli protokolga kichik o'zgartirishlar kiritilgan holda kuzatildi.Anti-b-tubulin antikorlari (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) va Alexa Fluor 488-konjugatsiyalangan sichqonchaga qarshi IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) birlamchi va ikkilamchi antikorlar sifatida 1:1000 va 1:10 suyultirishda ishlatilgan. mos ravishda.Floresan tasvirlari TCS SPE konfokal lazerli skanerlash mikroskopi (Leica Microsystems) yordamida olingan.Z-stack tasvirlarini oling va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq maksimal intensivlik proektsiyalarini yarating.
HeLa hujayra proliferatsiyasi tahlili ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq Cell Counting Kit 8 (Dojindo) yordamida amalga oshirildi.
E. coli DH5a ning o'sishi 600 nm (OD600) da spektrofotometr yordamida madaniyatdagi hujayra zichligini o'lchash yo'li bilan tahlil qilindi.
Transgen BY-2 hujayralarida sitoskeletal tashkilot CSU-X1 konfokal skanerlash qurilmasi (Yokogawa) va sCMOS kamerasi (Zyla, Andor Technology) bilan jihozlangan floresan mikroskop yordamida kuzatildi.Sitoskeletal zichlik tasvirni tahlil qilish yo'li bilan baholandi, u tasvirlanganidek ImageJ dasturidan foydalangan holda konfokal tasvirlardagi sitoplazmatik piksellar orasidagi sitoskeletal piksellarning foizini aniqladi38,39.
BY-2 hujayralarida hujayra o'limini aniqlash uchun hujayra suspenziyasining bir qismi xona haroratida 10 daqiqa davomida 0,05% Evans ko'k bilan inkubatsiya qilindi.O'lik hujayralarni selektiv Evans ko'k rangga bo'yash buzilmagan plazma membranasi tomonidan bo'yoqning hayotiy hujayralardan chiqib ketishiga bog'liq40.Bo'yalgan hujayralar yorqin maydon mikroskopi (BX53, Olympus) yordamida kuzatildi.
HeLa xujayralari 37 ° C va 5% CO2 da namlangan inkubatorda 10% FBS bilan to'ldirilgan DMEMda o'stirildi.Hujayralar 37 ° C da 6 soat davomida 100 mkM KAND 11, kumamonamik kislota 6, kumamonamid 1, 100 ng / ml kolsemid (Gibco) yoki 100 ng / ml Nocodmaze (Sigma) bilan ishlov berildi.Hujayralar MetOH bilan 10 daqiqa, so'ngra xona haroratida 5 daqiqa davomida asetat bilan mahkamlangan.Ruxsat etilgan hujayralar 0,5% BSA/PBS da 2 soat davomida suyultirilgan b-tubulin birlamchi antikor (1D4A4, Proteintech: 66240-1) bilan inkubatsiya qilindi, 3 marta TBST bilan yuvildi va keyin Alexa Fluor echki antikori bilan inkubatsiya qilindi.488 1 soat.– Sichqoncha IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) va 0,5% BSA/PBS da suyultirilgan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI).TBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, bo'yalgan hujayralar Nikon Eclipse Ti-E teskari mikroskopida kuzatildi.Tasvirlar MetaMorph dasturidan (molekulyar qurilmalar) foydalangan holda sovutilgan Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerasi bilan olingan.
Xabar vaqti: 2024 yil 17-iyun