Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS qo'llab-quvvatlashi cheklangan. Eng yaxshi natijalarga erishish uchun brauzeringizning yangi versiyasidan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublarsiz yoki JavaScriptsiz ko'rsatmoqdamiz.
Tabiiy mahsulotlarning kashf etilishi va ulardan foydali foydalanish inson hayotini yaxshilashga yordam beradi. O'simliklarning o'sishini inhibe qiluvchi kimyoviy moddalar begona o'tlarni nazorat qilish uchun gerbitsid sifatida keng qo'llaniladi. Turli xil gerbitsidlardan foydalanish zarurati tufayli yangi ta'sir mexanizmlariga ega birikmalarni aniqlash zarurati tug'iladi. Ushbu tadqiqotda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 dan yangi N-alkoksipirrol birikmasi, kumamonamidni kashf etdik va to'liq sintez jarayonini o'rnatdik. Biologik faollik tahlillari orqali biz urs-monoamik kislota urs-monoamidning sintetik oraliq mahsuloti va potentsial ekanligini aniqladik.o'simlik o'sishi inhibitoriBundan tashqari, biz turli xil urbenon kislotasi hosilalarini, jumladan, HeLa hujayralarining o'sishiga salbiy ta'sir ko'rsatmasdan yuqori gerbitsid faolligiga ega bo'lgan urbeniloksi hosilasini (UDA) ishlab chiqdik. Shuningdek, biz urmoton kislotasi hosilalari o'simlik mikrotubulalarini buzishini aniqladik; bundan tashqari, KAND aktin filamentlariga ta'sir qiladi va hujayralar o'limiga sabab bo'ladi; Bu ko'p qirrali ta'sirlar ma'lum mikrotubulalar ingibitorlaridan farq qiladi va urson kislotasi uchun yangi ta'sir mexanizmini taklif qiladi, bu esa yangi gerbitsidlarni ishlab chiqishda muhim afzallik hisoblanadi.
Foydali tabiiy mahsulotlar va ularning hosilalarini kashf etish va amaliy qo'llash inson hayoti sifatini yaxshilash vositasidir. Mikroorganizmlar, o'simliklar va hasharotlar tomonidan ishlab chiqarilgan ikkilamchi metabolitlar tibbiyot va qishloq xo'jaligida katta yutuqlarga olib keldi. Tabiiy mahsulotlardan ko'plab antibiotiklar va leykemiyaga qarshi dorilar ishlab chiqilgan. Bundan tashqari, turli xil turlaripestitsidlar, fungitsidlar va gerbitsidlar qishloq xo'jaligida foydalanish uchun ushbu tabiiy mahsulotlardan olinadi. Xususan, begona o'tlarga qarshi gerbitsidlar zamonaviy qishloq xo'jaligida hosildorlikni oshirish uchun muhim vositalar bo'lib, turli xil birikmalar allaqachon tijorat maqsadlarida qo'llaniladi. O'simliklardagi fotosintez, aminokislotalar metabolizmi, hujayra devori sintezi, mitozni tartibga solish, fitogormon signalizatsiyasi yoki oqsil sintezi kabi bir nechta hujayra jarayonlari gerbitsidlarning odatiy nishonlari hisoblanadi. Mikrotubulalar funktsiyasini inhibe qiluvchi birikmalar mitotik tartibga solishga ta'sir qilish orqali o'simliklarning o'sishiga ta'sir qiluvchi keng tarqalgan gerbitsidlar sinfidir2.
Mikrotubulalar sitoskeletning tarkibiy qismlari bo'lib, eukaryotik hujayralarda keng saqlanadi. Tubulin geterodimeri α-tubulin va β-tubulindan iborat bo'lib, chiziqli mikrotubula protofilamentlarini hosil qiladi, 13 ta protofilament esa silindrsimon tuzilishni hosil qiladi. Mikrotubulalar o'simlik hujayralarida ko'p rol o'ynaydi, jumladan, hujayra shaklini, hujayra bo'linishini va hujayra ichidagi transportni belgilaydi3,4. O'simlik hujayralari interfaza plazma membranasi ostida mikrotubulalarni o'z ichiga oladi va bu kortikal mikrotubulalar tsellyuloza sintaza komplekslarini boshqarish orqali tsellyuloza mikrofibrillalarining tashkil etilishini boshqaradi deb hisoblanadi4,5. Ildiz uchining tez cho'zilish zonasida joylashgan ildiz epidermal hujayralarining kortikal mikrotubulalari lateral joylashgan va tsellyuloza mikrofiberlari bu mikrotubulalarni kuzatib boradi va hujayra kengayish yo'nalishini cheklaydi, shu bilan anizotrop hujayra cho'zilishining rivojlanishiga yordam beradi. Shuning uchun mikrotubulalar funktsiyasi o'simlik morfologiyasi bilan chambarchas bog'liq. Tubulinni kodlovchi genlardagi aminokislota almashinuvi Arabidopsis 6,7 da kortikal mikrotubulalar massivlarining qiyshayishiga va chap yoki o'ng tomonga o'sishga olib keladi. Xuddi shunday, mikrotubulalar dinamikasini tartibga soluvchi mikrotubulalar bilan bog'liq oqsillardagi mutatsiyalar ham ildiz o'sishining buzilishiga olib kelishi mumkin8,9,10,11,12,13. Bundan tashqari, pretilaxlor deb ham ataladigan disopiramid kabi mikrotubulalarni buzuvchi gerbitsidlar bilan davolash ham chap tomonga qiyshiq ildiz o'sishiga olib keladi14. Bu ma'lumotlar shuni ko'rsatadiki, mikrotubulalar funktsiyasini aniq tartibga solish o'simlik o'sishi yo'nalishini aniqlash uchun juda muhimdir.
Mikrotubulalar ingibitorlarining turli turlari kashf etilgan va bu dorilar sitoskelet tadqiqotlariga, shuningdek, qishloq xo'jaligi va tibbiyotga katta hissa qo'shgan2. Xususan, oryzalin, dinitroanilin birikmalari, disopiramid, benzamid bilan bog'liq birikmalar va ularning analoglari mikrotubulalar funktsiyasini inhibe qilishi va shu bilan o'simliklarning o'sishini inhibe qilishi mumkin. Shuning uchun ular gerbitsid sifatida keng qo'llaniladi. Biroq, mikrotubulalar o'simlik va hayvon hujayralarining muhim tarkibiy qismi bo'lganligi sababli, mikrotubulalar ingibitorlarining aksariyati ikkala hujayra turi uchun ham sitotoksikdir. Shuning uchun, ularning gerbitsid sifatida tan olingan foydaliligiga qaramay, amaliy maqsadlar uchun cheklangan miqdordagi mikrotubulalarga qarshi vositalar qo'llaniladi.
Streptomyces - Streptomyces oilasiga mansub bo'lib, aerob, gram-musbat, filamentli bakteriyalarni o'z ichiga oladi va keng ko'lamli ikkilamchi metabolitlarni ishlab chiqarish qobiliyati bilan mashhur. Shuning uchun u yangi biologik faol tabiiy mahsulotlarning eng muhim manbalaridan biri hisoblanadi. Ushbu tadqiqotda biz Streptomyces werraensis MK493-CF1 va S. werraensis ISP 5486 dan ajratib olingan kumamonamid deb nomlangan yangi birikmani kashf etdik. Spektral tahlil va to'liq spektral tahlil yordamida kumamonamidning tuzilishi tavsiflandi va uning noyob N-alkoksipirrol skeleti aniqlandi. sintezi. Urmon kislotasi, urmonoamid va uning hosilalarining sintetik oraliq mahsuloti, mashhur model o'simlik Arabidopsis thaliana ning o'sishi va unib chiqishini inhibe qilishi aniqlandi. Tuzilish-faollik munosabatlarini o'rganishda biz urson kislotasiga modifikatsiyalangan C9 bilan urson kislotasining noniloksi hosilasi (KAND) deb ataladigan birikma o'sish va unib chiqishga inhibitiv ta'sirini sezilarli darajada oshirishini aniqladik. Shunisi e'tiborga loyiqki, yangi kashf etilgan o'simlik o'sishi inhibitori tamaki va jigar o'simligining o'sishiga ham ta'sir ko'rsatdi va bakteriyalar yoki HeLa hujayralari uchun sitotoksik emas edi. Bundan tashqari, ba'zi urmotonik kislota hosilalari ildiz fenotipining buzilishini keltirib chiqaradi, bu esa bu hosilalar mikrotubulalarga bevosita yoki bilvosita ta'sir qilishini anglatadi. Ushbu fikrga muvofiq, immunohistokimyoviy yoki lyuminestsent oqsillar bilan belgilangan mikrotubulalarni kuzatishimiz KAND bilan davolash mikrotubulalarni depolimerizatsiya qilishini ko'rsatadi. Bundan tashqari, kumamotonik kislota hosilalari bilan davolash aktin mikrofilamentlarini buzdi. Shunday qilib, biz noyob ta'sir mexanizmi sitoskeletni yo'q qilishni o'z ichiga olgan yangi o'simlik o'sishi inhibitorini kashf etdik.
MK493-CF1 shtammi Tokioning Shinagawa-ku shahrida tuproqdan ajratib olindi. MK493-CF1 shtammi yaxshi tarmoqlangan stromal mitseliy hosil qildi. 16S ribosomal RNK genining qisman ketma-ketligi (1422 bp) aniqlandi. Bu shtamm S. werraensisga juda o'xshash (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: tipik shtamm, 99.93%). Ushbu natijaga asoslanib, bu shtamm S. werraensis tipidagi shtamm bilan chambarchas bog'liqligi aniqlandi. Shuning uchun biz bu shtammni vaqtincha S. werraensis MK493-CF1 deb nomladik. S. werraensis ISP 5486T ham xuddi shunday bioaktiv birikmalarni ishlab chiqaradi. Ushbu mikroorganizmdan tabiiy mahsulotlarni olish bo'yicha dastlabki tadqiqotlar kam bo'lganligi sababli, qo'shimcha kimyoviy tadqiqotlar olib borildi. S. werraensis MK493-CF1 ni arpa muhitida 30°C da 14 kun davomida qattiq holatda fermentatsiya qilish orqali yetishtirgandan so'ng, muhit 50% EtOH bilan ekstraksiya qilindi. 59,5 mg xom ekstrakt olish uchun 60 ml namuna quritildi. Xom ekstrakt N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid (1, kumamonamid deb ataladi, 36,0 mg) olish uchun teskari fazali HPLC ga duchor qilindi. 1 ning umumiy miqdori xom ekstraktning taxminan 60% ni tashkil qiladi. Shuning uchun biz kumamotoamid 1 ning xususiyatlarini batafsil o'rganishga qaror qildik.
Kumamonamid 1 oq amorf kukun bo'lib, yuqori aniqlikdagi massa spektrometriyasi (HRESIMS) C6H8N2O2 ni tasdiqlaydi (1-rasm). Ushbu birikmaning C2 bilan almashtirilgan pirrol fragmenti δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH 1H NMR spektrida: 4.5 Hz, H-5) va δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6) bilan tavsiflanadi va 13C NMR spektrida to'rtta sp2 uglerod atomining mavjudligi ko'rsatilgan. C2 pozitsiyasida amid guruhining mavjudligi δC 161.1 da C-3 protonidan amid karbonil uglerodga HMBC korrelyatsiyasi orqali baholandi. Bundan tashqari, δH 4.10 (3H, S) va δC 68.3 da 1 H va 13C NMR cho'qqilari molekulada N-metoksi guruhlari mavjudligini ko'rsatadi. Metoksi guruhining to'g'ri pozitsiyasi hali kengaytirilgan farq spektroskopiyasi va yadroviy Overhauser qisqartmasi (NOEDF) kabi spektroskopik tahlil yordamida aniqlanmagan bo'lsa-da, N-metoksi-1H-pirrol-2-karboksamid birinchi nomzod birikmaga aylandi.
1 ning to'g'ri tuzilishini aniqlash uchun to'liq sintez amalga oshirildi (2a-rasm). Tijoratda mavjud bo'lgan 2-aminopiridin 2 ni m-CPBA bilan qayta ishlash natijasida miqdoriy hosil bo'yicha mos keladigan N-oksid 3 olindi. 2 ning 2-aminoazidlanishidan so'ng, Abramovich tomonidan tasvirlangan siklokondensatsiya reaksiyasi kerakli 1-gidroksi-1H-pirrol-2-karbonitril 5 grammni olish uchun 90°C da benzolda amalga oshirildi. Tezlik 60% (ikki bosqich). 15,16. Keyin 4 ning metillanishi va gidrolizi yaxshi hosil bilan (70%, ikki bosqich) 1-metoksi-1H-pirrol-2-karbon kislotasini ("kumoton kislotasi" deb ataladi, 6) berdi. Nihoyat, suvli ammiak yordamida kislota xlorid oraliq mahsuloti 6 orqali amidlash Kumamoto amid 1 ni 98% hosil bilan berdi. Sintezlangan 1 ning barcha spektral ma'lumotlari izolyatsiya qilingan 1 ga o'xshash edi, shuning uchun 1 ning tuzilishi aniqlandi;
Urbenamid va urben kislotasining biologik faolligining umumiy sintezi va tahlili. (a) Kumamoto amidining to'liq sintezi. (b) Yetti kunlik yovvoyi turdagi Arabidopsis Columbia (Col) ko'chatlari ko'rsatilgan konsentratsiyalarda kumamonamid 6 yoki kumamonamid 1 ni o'z ichiga olgan Murashige va Skoog (MS) plastinkalarida o'stirildi. Masshtab chizig'i = 1 sm.
Birinchidan, biz urbenamid va uning oraliq mahsulotlarining o'simliklarning o'sishini modulyatsiya qilish qobiliyatiga qarab biologik faolligini baholadik. Biz MS agar muhitiga turli konsentratsiyali urmonamid 1 yoki urmon kislotasi 6 qo'shdik va ushbu muhitda Arabidopsis thaliana ko'chatlarini kultivatsiya qildik. Ushbu tahlillar shuni ko'rsatdiki, 6 ning yuqori konsentratsiyalari (500 μM) ildiz o'sishini inhibe qildi (2b-rasm). Keyin, biz 6 ning N1 pozitsiyasini almashtirish orqali turli xil hosilalarni yaratdik va ularda struktura-faollik munosabatlari bo'yicha tadqiqotlar o'tkazdik (analog sintez jarayoni Qo'shimcha ma'lumotlarda (SI) tasvirlangan). Arabidopsis ko'chatlari 50 μM urson kislotasi hosilalarini o'z ichiga olgan muhitda o'stirildi va ildiz uzunligi rasmda ko'rsatilganidek o'lchandi. 3a, b va S1 rasmlarda ko'rsatilganidek, kumamo kislotalari N1 pozitsiyasida turli uzunlikdagi chiziqli alkoksi zanjirlarga (9, 10, 11, 12 va 13) yoki katta alkoksi zanjirlarga (15, 16 va 17) ega. Hosil bo'lgan mahsulotlar ildiz o'sishini sezilarli darajada inhibe qildi. Bundan tashqari, biz 200 μM 10, 11 yoki 17 ni qo'llash unib chiqishni inhibe qilganini aniqladik (3c va S2-rasmlar).
Kumamoto amid va unga bog'liq birikmalarning struktura-faollik munosabatini o'rganish. (a) Analoglarning tuzilishi va sintez sxemasi. (b) 50 μM kumamonamid hosilalari bilan yoki ularsiz MS muhitida o'stirilgan 7 kunlik ko'chatlarning ildiz uzunligini miqdoriy aniqlash. Yulduzchalar soxta ishlov berish bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t-test, p<0.05). n>18. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan. nt "sinovdan o'tkazilmagan" degan ma'noni anglatadi, chunki urug'larning 50% dan ortig'i unib chiqmagan. (c) 200 μM kumamonamid va unga bog'liq birikmalar bilan yoki ularsiz MS muhitida 7 kun davomida inkubatsiya qilingan ishlov berilgan urug'larning unib chiqish tezligini miqdoriy aniqlash. Yulduzchalar soxta ishlov berish bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (xi-kvadrat testi). n=96.
Qizig'i shundaki, C9 dan uzunroq alkil yon zanjirlarining qo'shilishi inhibitiv faollikni kamaytirdi, bu kumamoot kislotasi bilan bog'liq birikmalar o'zlarining biologik faolligini namoyish etish uchun ma'lum o'lchamdagi yon zanjirlarga muhtojligini ko'rsatadi.
Struktura-faollik munosabatlari tahlili shuni ko'rsatdiki, C9 urson kislotasiga o'zgartirilgan va urson kislotasining noniloksi hosilasi (bundan keyin KAND 11 deb yuritiladi) eng samarali o'simlik o'sishi inhibitori bo'lganligi sababli, biz KAND 11 ning batafsil tavsifini o'tkazdik. Arabidopsisni 50 μM KAND 11 bilan davolash deyarli unib chiqishni to'liq oldini oldi, KAND 11 ning past konsentratsiyalari (40, 30, 20 yoki 10 μM) esa ildiz o'sishini dozaga bog'liq ravishda inhibe qildi (4a, b-rasm). KAND 11 ildiz meristemasining hayotiyligiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini tekshirish uchun biz propidium yodid (PI) bilan bo'yalgan ildiz meristemalarini tekshirdik va meristema maydoni hajmini o'lchadik. 25 μM KAND-11 saqlovchi muhitda o'stirilgan ko'chatlarning meristemasining o'lchami 151,1 ± 32,5 μm ni tashkil etdi, DMSO saqlovchi nazorat muhitida o'stirilgan ko'chatlarning meristemasining o'lchami esa 264,7 ± 30,8 μm ni tashkil etdi (4c, d-rasm), bu KAND-11 hujayra faolligini tiklayotganini ko'rsatadi. tarqalish. Ildiz meristemasi. Bunga muvofiq, KAND 11 bilan davolash ildiz meristemasidagi CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS hujayra bo'linish markerining miqdorini kamaytirdi (4e-rasm) 17. Bu natijalar KAND 11 hujayra proliferatsiyasi faolligini kamaytirish orqali ildiz o'sishini inhibe qilishini ko'rsatadi.
Urbenon kislotasi hosilalarining (urbeniloksi hosilalari) o'sishga inhibitiv ta'sirini tahlil qilish. (a) KAND 11 ning ko'rsatilgan konsentratsiyalari bilan MS plastinkalarida o'stirilgan 7 kunlik yovvoyi turdagi Col ko'chatlari. Masshtab chizig'i = 1 sm. (b) Ildiz uzunligini miqdoriy aniqlash. Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p<0.05). n>16. Ma'lumotlar o'rtacha ± SD sifatida ko'rsatilgan. (c) 25 μM KAND bilan yoki KANDsiz MS plastinkalarida o'stirilgan propidium yodid bilan bo'yalgan yovvoyi tipdagi Col ildizlarining konfokal mikroskopiyasi. 11. Oq qavslar ildiz meristemasini bildiradi. Masshtab chizig'i = 100 μm. (d) Ildiz meristemasining hajmini aniqlash (n = 10 dan 11 gacha). Statistik farqlar t-test yordamida aniqlandi (p< 0,05). Chiziqlar o'rtacha meristema hajmini ifodalaydi. (e) CDKB2 konstruktsiyasini o'z ichiga olgan ildiz meristemasining differentsial interferentsiya kontrasti (DIC) mikroskopiyasi; 1pro: CDKB2; 25 µM KAND tahlili bilan yoki tahlilisiz MS plastinkalarida o'stirilgan 5 kunlik ko'chatlarga 1-GUS bo'yalgan va bo'yalgan.
KAND 11 ning fitotoksikligi yana bir ikki pallali o'simlik, tamaki (Nicotiana tabacum) va asosiy quruqlik o'simlik modeli organizmi, jigarwort (Marchantia polymorpha) yordamida qo'shimcha ravishda sinovdan o'tkazildi. Arabidopsis misolida bo'lgani kabi, 25 μM KAND 11 ni o'z ichiga olgan muhitda o'stirilgan tamaki SR-1 ko'chatlari qisqaroq ildizlar hosil qildi (5a-rasm). Bundan tashqari, 48 ta urug'dan 40 tasi 200 μM KAND 11 ni o'z ichiga olgan plastinkalarda unib chiqdi, 48 ta urug'ning barchasi esa ishlov berilgan muhitda unib chiqdi, bu esa KAND ning yuqori konsentratsiyasi sezilarli ekanligini ko'rsatadi (p<0,05; chi testi -kvadrat) tamaki unib chiqishini inhibe qildi. (5b-rasm). Bundan tashqari, jigar o'simligida bakteriyalar o'sishini inhibe qilgan KAND 11 konsentratsiyasi Arabidopsisdagi samarali konsentratsiyaga o'xshash edi (5c-rasm). Bu natijalar KAND 11 turli xil o'simliklarning o'sishini inhibe qilishi mumkinligini ko'rsatadi. Keyin biz boshqa organizmlarda, ya'ni inson HeLa hujayralarida va Escherichia coli shtammi DH5α shtammida ayiq monoamid bilan bog'liq birikmalarning yuqori hayvon va bakterial hujayralarning vakillari sifatida mumkin bo'lgan sitotoksikligini tekshirdik. Bir qator hujayra proliferatsiyasi tahlillarida biz kumamonamid 1, kumamonamid kislotasi 6 va KAND 11 100 μM konsentratsiyalarda HeLa yoki E. coli hujayralarining o'sishiga ta'sir qilmaganligini kuzatdik (5d,e-rasm).
Arabidopsis bo'lmagan organizmlarda KAND 11 ning o'sishini inhibe qilish. (a) Ikki haftalik yovvoyi turdagi SR-1 tamaki ko'chatlari 25 μM KAND 11 ni o'z ichiga olgan vertikal joylashtirilgan MS plastinkalarida o'stirildi. (b) Ikki haftalik yovvoyi turdagi SR-1 tamaki ko'chatlari 200 μM KAND 11 ni o'z ichiga olgan gorizontal joylashtirilgan MS plastinkalarida o'stirildi. (c) Ko'rsatilgan KAND 11 konsentratsiyasi bilan Gamborg B5 plastinkalarida o'stirilgan ikki haftalik yovvoyi turdagi Tak-1 jigar o'simtasi kurtaklari. Qizil strelkalar ikki haftalik inkubatsiya davrida o'sishni to'xtatgan sporalarni ko'rsatadi. (d) HeLa hujayralarining hujayra proliferatsiyasi tahlili. Hayotiy hujayralar soni belgilangan vaqt oralig'ida hujayralarni hisoblash to'plami 8 (Dojindo) yordamida o'lchandi. Nazorat sifatida HeLa hujayralari RNK polimeraza transkripsiyasini inhibe qiladigan va hujayra o'limiga olib keladigan 5 μg/ml aktinomitsin D (D harakati) bilan ishlov berildi. Tahlillar uch nusxada o'tkazildi. (e) E. coli hujayra proliferatsiyasi tahlili. E. coli o'sishi OD600 ni o'lchash orqali tahlil qilindi. Nazorat guruhi sifatida hujayralarga bakterial hujayra devori sintezini inhibe qiluvchi 50 mkg/ml ampitsillin (Amp) berildi. Tahlillar uch nusxada o'tkazildi.
Uramid bilan bog'liq birikmalar keltirib chiqaradigan sitotoksiklikning ta'sir mexanizmini aniqlash uchun biz rasmda ko'rsatilgandek, o'rtacha inhibitiv ta'sirga ega urben kislotasi hosilalarini qayta tahlil qildik. 2b, 6a-rasmlarda ko'rsatilgandek, urmoton kislotasi 6 ning yuqori konsentratsiyasini (200 μM) o'z ichiga olgan agar plastinkalarida o'stirilgan ko'chatlar qisqaroq va chapga egri ildizlarni hosil qildi (θ = – 23.7 ± 6.1), nazorat muhitida o'stirilgan ko'chatlar esa deyarli tekis ildizlarni hosil qildi (θ = – 3.8 ± 7.1). Bu xarakterli qiyshiq o'sish kortikal mikrotubulalarning disfunktsiyasidan kelib chiqishi ma'lum14,18. Ushbu topilmaga muvofiq, mikrotubulalarni beqarorlashtiruvchi disopiramid va oryzalin preparatlari bizning o'sish sharoitimizda shunga o'xshash ildiz qiyshayishini keltirib chiqardi (2b, 6a-rasmlar). Shu bilan birga, biz urmoton kislotasi hosilalarini sinab ko'rdik va ma'lum konsentratsiyalarda qiyshiq ildiz o'sishini keltirib chiqaradigan bir nechtasini tanladik. 8, 9 va 15-birikmalar mos ravishda 75 μM, 50 μM va 40 μM da ildiz o'sishi yo'nalishini o'zgartirdi, bu esa bu birikmalar mikrotubulalarni samarali ravishda beqarorlashtirishi mumkinligini ko'rsatadi (2b-rasm, 6a). Shuningdek, biz eng kuchli ursolik kislota hosilasi KAND 11 ni pastroq konsentratsiyada (15 μM) sinab ko'rdik va KAND 11 ni qo'llash ildiz o'sishini inhibe qilishini va ildiz o'sishi yo'nalishi notekis ekanligini aniqladik, garchi ular chapga qiyalikqa moyil bo'lsa ham (C3-rasm). Mikrotubulalarni beqarorlashtiruvchi dorilarning yuqori konsentratsiyasi ba'zan ildizning qiyshayishiga olib kelish o'rniga o'simlik o'sishini inhibe qilganligi sababli, keyinchalik biz KAND 11 ning ildiz epidermal hujayralarida kortikal mikrotubulalarni kuzatish orqali mikrotubulalarga ta'sir qilish ehtimolini baholadik. 25 μM KAND 11 bilan ishlov berilgan ko'chat ildizlarining epidermal hujayralarida anti-β-tubulin antikorlaridan foydalangan holda immunohistokimyo cho'zilish zonasida epidermal hujayralardagi deyarli barcha kortikal mikrotubulalarning yo'q bo'lib ketishini ko'rsatdi (6b-rasm). Bu natijalar kumamoton kislotasi va uning hosilalari mikrotubulalarga to'g'ridan-to'g'ri yoki bilvosita ta'sir qilib, ularni buzishini va bu birikmalar yangi mikrotubulalar ingibitorlari ekanligini ko'rsatadi.
Urson kislotasi va uning hosilalari Arabidopsis thaliana o'simligidagi kortikal mikrotubulalarni o'zgartiradi. (a) Ko'rsatilgan konsentratsiyalarda turli urmoton kislotasi hosilalari ishtirokida o'lchangan ildiz qiyalik burchagi. Mikrotubulalarni inhibe qilishi ma'lum bo'lgan ikkita birikmaning: disopiramid va oryzalinning ta'siri ham tahlil qilindi. Qo'shimchada ildiz o'sish burchagini o'lchash uchun ishlatiladigan standart ko'rsatilgan. Yulduzchalar soxta davolash bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t testi, p<0.05). n>19. Masshtab chizig'i = 1 sm. (b) Cho'zilish zonasidagi epidermal hujayralardagi kortikal mikrotubulalar. 25 μM KAND 11 bilan yoki bo'lmasdan MS plastinkalarida o'stirilgan yovvoyi tipdagi Arabidopsis Col ildizlaridagi mikrotubulalar β-tubulin birlamchi antikorlari va Alexa Fluor bilan konjuge qilingan ikkilamchi antikorlar yordamida immunohistokimyoviy bo'yash orqali vizualizatsiya qilindi. Masshtab chizig'i = 10 μm. (c) Ildiz meristemasidagi mikrotubulalarning mitotik tuzilishi. Mikrotubulalar immunohistokimyoviy bo'yash yordamida vizualizatsiya qilindi. Profaza zonalari, shpindellari va fragmoplastlar kabi mitotik tuzilmalar konfokal tasvirlardan sanab chiqildi. Strelkalar mitotik mikrotubula tuzilmalarini ko'rsatadi. Yulduzchalar soxta davolash bilan sezilarli farqlarni ko'rsatadi (t testi, p<0.05). n>9. Masshtab chizig'i = 50 µm.
Ursa mikrotubulalar funktsiyasini buzish qobiliyatiga ega bo'lsa-da, uning ta'sir mexanizmi odatiy mikrotubulalarni depolimerizatsiya qiluvchi vositalardan farq qilishi kutilmoqda. Masalan, disopiramid va oryzalin kabi mikrotubulalarni depolimerizatsiya qiluvchi vositalarning yuqori konsentratsiyasi epidermal hujayralarning anizotrop kengayishiga olib keladi, KAND 11 esa bunday qilmaydi. Bundan tashqari, KAND 11 va disopiramidni birgalikda qo'llash disopiramid tomonidan qo'zg'atilgan ildiz o'sishiga javoban va KAND 11 tomonidan qo'zg'atilgan o'sish inhibatsiyasi kuzatildi (S4-rasm). Shuningdek, biz o'ta sezgir disopiramid 1-1 (phs1-1) mutantining KAND 11 ga javobini tahlil qildik. phs1-1 noan'anaviy tubulin kinaz nuqtasi mutatsiyasiga ega va disopiramid9,20 bilan ishlov berilganda qisqaroq ildizlar hosil qiladi. KAND 11 ni o'z ichiga olgan agar muhitida o'stirilgan phs1-1 mutant ko'chatlari disopiramidda o'stirilganlarga o'xshash qisqaroq ildizlarga ega edi (S5-rasm).
Bundan tashqari, biz KAND 11 bilan ishlov berilgan ko'chatlarning ildiz meristemasida profaza zonalari, shpindellari va fragmoplastlar kabi mitotik mikrotubulalar tuzilmalarini kuzatdik. CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS kuzatuvlariga muvofiq, mitotik mikrotubulalar sonining sezilarli darajada kamayishi kuzatildi (6c-rasm).
KAND 11 ning subhujayraviy yechimdagi sitotoksikligini tavsiflash uchun biz tamaki BY-2 suspenziya hujayralarini KAND 11 bilan ishlov berdik va ularning javobini kuzatdik. KAND 11 ning kortikal mikrotubulalarga ta'sirini baholash uchun avval mikrotubulalarni lyuminestsent tarzda belgilaydigan TagRFP-TUA6 ni ifodalovchi BY-2 hujayralariga KAND 11 qo'shdik. Kortikal mikrotubulalar zichligi tasvir tahlili yordamida baholandi, bu sitoplazmatik piksellar orasidagi sitoskelet piksellarining foizini aniqladi. Tahlil natijalari shuni ko'rsatdiki, 50 μM yoki 100 μM KAND 11 bilan 1 soat davomida ishlov berilgandan so'ng, zichlik mos ravishda 0,94 ± 0,74% yoki 0,23 ± 0,28% gacha sezilarli darajada pasaydi, DMSO bilan ishlov berilgan hujayralarning zichligi esa 1,61 ± 0,34% ni tashkil etdi (7a-rasm). Bu natijalar Arabidopsisdagi KAND 11 bilan davolash kortikal mikrotubulalarning depolimerizatsiyasini keltirib chiqarishi haqidagi kuzatuvga mos keladi (6b-rasm). Shuningdek, biz KAND 11 ning bir xil konsentratsiyasi bilan ishlov berilgandan so'ng GFP-ABD bilan belgilangan aktin filamentlari bilan BY-2 liniyasini tekshirdik va KAND 11 bilan davolash aktin filamentlarini buzganligini kuzatdik. 50 μM yoki 100 μM KAND 11 bilan 1 soat davomida ishlov berish aktin filament zichligini mos ravishda 1,20 ± 0,62% yoki 0,61 ± 0,26% gacha sezilarli darajada kamaytirdi, DMSO bilan ishlov berilgan hujayralardagi zichlik esa 1,69 ± 0,51% ni tashkil etdi (2-rasm). 7b). Bu natijalar aktin filamentlariga ta'sir qilmaydigan propizamid va mikrotubulalarga ta'sir qilmaydigan aktin depolimerizatori latrunkulin B ning ta'siridan farq qiladi (SI S6-rasm). Bundan tashqari, kumamonamid 1, kumamonamid kislotasi 6 yoki KAND 11 bilan davolash HeLa hujayralaridagi mikrotubulalarga ta'sir qilmadi (SI S7-rasm). Shunday qilib, KAND 11 ning ta'sir mexanizmi ma'lum sitoskelet buzuvchilarinikidan farq qiladi deb ishoniladi. Bundan tashqari, KAND 11 bilan davolangan BY-2 hujayralarini mikroskopik kuzatishimiz KAND 11 bilan davolash paytida hujayra o'limining boshlanishini aniqladi va Evans ko'k rangga bo'yalgan o'lik hujayralarning ulushi KAND 11 bilan davolashning 30 daqiqasidan keyin sezilarli darajada oshmaganligini, 50 μM yoki 100 μM KAND bilan 90 daqiqa davolangandan so'ng esa o'lik hujayralar soni mos ravishda 43,7% yoki 80,1% gacha oshganligini ko'rsatdi (7c-rasm). Birgalikda, bu ma'lumotlar yangi ursolik kislota hosilasi KAND 11 ilgari noma'lum ta'sir mexanizmiga ega bo'lgan o'simlikka xos sitoskelet inhibitori ekanligini ko'rsatadi.
KAND tamaki BY-2 hujayralarining kortikal mikrotubulalariga, aktin filamentlariga va hayotiyligiga ta'sir qiladi. (a) TagRFP-TUA6 ishtirokida BY-2 hujayralaridagi kortikal mikrotubulalarni vizualizatsiya qilish. KAND 11 (50 μM yoki 100 μM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari konfokal mikroskopiya yordamida tekshirildi. Kortikal mikrotubulalar zichligi 25 ta mustaqil hujayralarning mikrograflaridan hisoblab chiqildi. Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p<0,05). Masshtab chizig'i = 10 µm. (b) GFP-ABD2 ishtirokida ko'rsatilgan BY-2 hujayralaridagi kortikal aktin filamentlari. KAND 11 (50 µM yoki 100 µM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari konfokal mikroskopiya yordamida tekshirildi. Kortikal aktin filamentlarining zichligi 25 ta mustaqil hujayralarning mikrograflaridan hisoblab chiqildi. Harflar sezilarli farqlarni ko'rsatadi (Tukey HSD testi, p<0.05). Masshtab chizig'i = 10 µm. (c) Evans ko'k bo'yog'i yordamida o'lik BY-2 hujayralarini kuzatish. KAND 11 (50 µM yoki 100 µM) yoki DMSO bilan ishlov berilgan BY-2 hujayralari yorqin maydonli mikroskopiya yordamida tekshirildi. n=3. Masshtab chizig'i = 100 µm.
Yangi tabiiy mahsulotlarning kashf etilishi va qo'llanilishi inson hayotining turli jabhalarida, jumladan, tibbiyot va qishloq xo'jaligida sezilarli yutuqlarga olib keldi. Tabiiy resurslardan foydali birikmalar olish uchun tarixiy tadqiqotlar olib borildi. Xususan, aktinomitsetlar nematodalar uchun parazitlarga qarshi antibiotiklar sifatida foydali ekanligi ma'lum, chunki ular turli xil ikkilamchi metabolitlarni, masalan, ivermektin va bleomitsinning qo'rg'oshin birikmasi bo'lgan avermektin va uning hosilalarini ishlab chiqarish qobiliyatiga ega bo'lib, ular saratonga qarshi vosita sifatida tibbiy maqsadlarda qo'llaniladi21,22. Xuddi shunday, aktinomitsetlardan turli xil gerbitsid birikmalari topilgan, ularning ba'zilari allaqachon tijorat maqsadlarida qo'llanilmoqda1,23. Shuning uchun, kerakli biologik faollikka ega tabiiy mahsulotlarni ajratib olish uchun aktinomitset metabolitlarini tahlil qilish samarali strategiya hisoblanadi. Ushbu tadqiqotda biz S. werraensisdan yangi birikma, kumamonamidni topdik va uni muvaffaqiyatli sintez qildik. Urson kislotasi urbenamid va uning hosilalarining sintetik oraliq mahsulotidir. U xarakterli ildizlarning burishishiga olib kelishi, o'rtacha va kuchli gerbitsid faolligini namoyon qilishi va o'simlik mikrotubulalariga bevosita yoki bilvosita zarar etkazishi mumkin. Biroq, urmoton kislotasining ta'sir mexanizmi mavjud mikrotubulalar ingibitorlarinikidan farq qilishi mumkin, chunki KAND 11 aktin filamentlarini ham buzadi va hujayra o'limiga olib keladi, bu urmoton kislotasi va uning hosilalari sitoskelet tuzilmalarining keng doirasiga ta'sir qiladigan tartibga solish mexanizmini ko'rsatadi.
Urbenon kislotasining batafsil tavsifi urbenon kislotasining ta'sir mexanizmini yaxshiroq tushunishga yordam beradi. Xususan, keyingi maqsad urson kislotasining kamaytirilgan mikrotubulalarga bog'lanish qobiliyatini baholash, urson kislotasi va uning hosilalari to'g'ridan-to'g'ri mikrotubulalarga ta'sir qiladimi va ularni depolimerlashtiradimi yoki ularning ta'siri mikrotubulalarning beqarorlashishiga olib keladimi yoki yo'qligini aniqlashdir. Bundan tashqari, mikrotubulalar to'g'ridan-to'g'ri nishon bo'lmagan hollarda, urson kislotasining o'simlik hujayralariga ta'sir qilish joyini va molekulyar nishonlarini aniqlash tegishli birikmalarning xususiyatlarini va gerbitsid faolligini oshirishning mumkin bo'lgan usullarini yanada yaxshiroq tushunishga yordam beradi. Bizning bioaktivlik tahlilimiz urson kislotasining Arabidopsis thaliana, tamaki va jigar o'ti kabi o'simliklarning o'sishiga noyob sitotoksik qobiliyatini aniqladi, shu bilan birga na E. coli, na HeLa hujayralari ta'sirlanmadi. Urson kislotasi hosilalari ochiq qishloq xo'jaligi dalalarida foydalanish uchun gerbitsid sifatida ishlab chiqilgan bo'lsa, ularning hayvon hujayralari uchun toksikligi kam yoki umuman yo'qligi afzallik hisoblanadi. Darhaqiqat, mikrotubulalar eukaryotlarda keng tarqalgan tuzilmalar bo'lgani uchun, ularning o'simliklarda selektiv inhibisyonu gerbitsidlar uchun asosiy talab hisoblanadi. Masalan, tubulin bilan bevosita bog'lanadigan va polimerlanishni inhibe qiladigan mikrotubulalarni depolimerizatsiya qiluvchi vosita bo'lgan propizamid hayvon hujayralari uchun past toksikligi tufayli gerbitsid sifatida ishlatiladi24. Disopiramiddan farqli o'laroq, tegishli benzamidlar turli xil nishonga xos xususiyatlarga ega. O'simlik mikrotubulalaridan tashqari, RH-4032 yoki benzoksamid ham mos ravishda hayvon hujayralari yoki oomitsetlarning mikrotubulalarini inhibe qiladi va zalilamid past fitotoksikligi tufayli fungitsid sifatida ishlatiladi25,26,27. Yangi kashf etilgan ayiq va uning hosilalari o'simliklarga nisbatan selektiv sitotoksiklikni namoyon etadi, ammo shuni ta'kidlash kerakki, keyingi modifikatsiyalar ularning nishonga xosligini o'zgartirishi mumkin, bu esa patogen zamburug'lar yoki oomitsetlarni nazorat qilish uchun qo'shimcha hosilalarni taqdim etishi mumkin.
Urbenon kislotasi va uning hosilalarining noyob xususiyatlari ularni gerbitsidlar sifatida ishlab chiqish va tadqiqot vositalari sifatida foydalanish uchun foydalidir. Sitoskeletning o'simlik hujayralari shaklini boshqarishdagi ahamiyati keng e'tirof etilgan. Avvalgi tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, o'simliklar morfogenezni to'g'ri boshqarish uchun mikrotubulalar dinamikasini boshqarish orqali kortikal mikrotubulalarni tashkil qilishning murakkab mexanizmlarini rivojlantirgan. Mikrotubulalar faolligini tartibga solish uchun mas'ul bo'lgan ko'plab molekulalar aniqlangan va tegishli tadqiqotlar hali ham davom etmoqda3,4,28. O'simlik hujayralarida mikrotubulalar dinamikasi haqidagi hozirgi tushunchamiz kortikal mikrotubulalarni tashkil qilish mexanizmlarini to'liq tushuntirmaydi. Masalan, disopiramid ham, orizalin ham mikrotubulalarni depolimerlashtirishi mumkin bo'lsa-da, disopiramid ildizlarning jiddiy deformatsiyasiga olib keladi, orizalin esa nisbatan yumshoq ta'sirga ega. Bundan tashqari, mikrotubulalarni barqarorlashtiradigan tubulindagi mutatsiyalar ildizlarda dekstrorotatsiyaga ham olib keladi, mikrotubulalar dinamikasini ham barqarorlashtiradigan paklitaksel esa bunday qilmaydi. Shuning uchun, ursolik kislotaning molekulyar nishonlarini o'rganish va aniqlash o'simlik kortikal mikrotubulalarini boshqarish bo'yicha yangi tushunchalar berishi kerak. Xuddi shunday, kelajakda disopiramid kabi buzilgan o'sishni rag'batlantirishda samarali bo'lgan kimyoviy moddalarni va oryzalin yoki kumamotor kislota kabi kamroq samarali kimyoviy moddalarni taqqoslash buzilgan o'sish qanday sodir bo'lishini ko'rsatuvchi ko'rsatmalar beradi.
Boshqa tomondan, mudofaa bilan bog'liq sitoskelet qayta joylashuvi urson kislotasining sitotoksikligini tushuntirishning yana bir imkoniyatidir. Patogenning infektsiyasi yoki o'simlik hujayralariga qo'zg'atuvchining kiritilishi ba'zan sitoskeletning yo'q qilinishiga va keyinchalik hujayra o'limiga olib keladi29. Masalan, oomitsetdan olingan kriptoksantin tamaki hujayralari o'limidan oldin mikrotubulalar va aktin filamentlarini buzishi haqida xabar berilgan, bu KAND bilan davolashda sodir bo'ladigan holatga o'xshaydi30,31. Himoya reaksiyalari va urson kislotasi tomonidan qo'zg'atilgan hujayra reaksiyalari o'rtasidagi o'xshashliklar bizni ular umumiy hujayra jarayonlarini qo'zg'atishi mumkinligi haqidagi farazga olib keldi, garchi urson kislotasining kriptoksantinga qaraganda tezroq va kuchliroq ta'siri aniq. Biroq, tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, aktin filamentlarining buzilishi o'z-o'zidan hujayra o'limini kuchaytiradi, bu har doim ham mikrotubulalarning buzilishi bilan birga kelmaydi29. Bundan tashqari, urson kislotasi hosilalari kabi patogen yoki qo'zg'atuvchi ildiz o'sishining buzilishiga olib keladimi yoki yo'qmi, hali aniq emas. Shunday qilib, mudofaa reaksiyalari va sitoskeletni bog'laydigan molekulyar bilim hal qilinishi kerak bo'lgan jozibali muammodir. Urson kislotasi bilan bog'liq past molekulyar og'irlikdagi birikmalar, shuningdek, turli xil potentsialga ega bo'lgan bir qator hosilalardan foydalanish orqali ular noma'lum hujayra mexanizmlarini nishonga olish imkoniyatlarini yaratishi mumkin.
Umuman olganda, mikrotubulalar dinamikasini modulyatsiya qiluvchi yangi birikmalarning kashf etilishi va qo'llanilishi o'simlik hujayralari shaklini aniqlashning murakkab molekulyar mexanizmlarini hal qilish uchun kuchli usullarni taqdim etadi. Shu nuqtai nazardan, yaqinda ishlab chiqilgan mikrotubulalar va aktin filamentlariga ta'sir qiluvchi va hujayra o'limini keltirib chiqaradigan urmotonik kislota birikmasi mikrotubulalarni boshqarish va ushbu boshqa mexanizmlar o'rtasidagi bog'liqlikni aniqlash imkoniyatini yaratishi mumkin. Shunday qilib, urbenon kislotasidan foydalangan holda kimyoviy va biologik tahlil bizga o'simlik sitoskeletini boshqaradigan molekulyar tartibga solish mexanizmlarini tushunishga yordam beradi.
S. werraensis MK493-CF1 ni 2% (w/v) galaktoza, 2% (w/v) Essence pastasi, 1% (w/v) Bacto tarkibidan iborat 110 ml urug'lik muhiti bo'lgan 500 ml chalkashtirilgan Erlenmeyer kolbasiga emlang. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0,5% (w/v) makkajo'xori ekstrakti (KOGOSTCH Co., Ltd., Yaponiya), 0,2% (w/v) (NH4)2SO4 va 0,2% CaCO3 deionizatsiyalangan suvda (sterilizatsiya qilishdan oldin pH 7,4). Urug'lik kulturalari 27°C da 2 kun davomida aylanuvchi silkitgichda (180 rpm) inkubatsiya qilindi. Qattiq holatdagi fermentatsiya orqali ishlab chiqarishni yetishtirish. Urug'lik kulturasi (7 ml) 15 g presslangan arpa (MUSO Co., Ltd., Yaponiya) va 25 g deionizatsiyalangan suvdan (sterilizatsiya qilishdan oldin pH sozlanmagan) iborat 40 g ishlab chiqarish muhiti bo'lgan 500 ml K-1 kolbasiga o'tkazildi. Fermentatsiya 30°C da qorong'i joyda 14 kun davomida amalga oshirildi. Fermentatsiya materiali 40 ml/shisha EtOH bilan ekstraksiya qilindi va santrifuga qilindi (1500 g, 4°C, 10 daqiqa). Kultura ustki qatlami (60 ml) 10% MeOH/EtOAc aralashmasi bilan ekstraksiya qilindi. Organik qatlam qoldiq (59,5 mg) olish uchun pasaytirilgan bosim ostida bug'lantirildi, u teskari fazali ustunda (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × uzunlik 250 mm) gradientli elyutsiyasi bilan HPLCga (0–10 daqiqa: 90%) duchor qilindi. H2O/CH3CN, 10–35 daqiqa: 90% H2O/CH3CN dan 70% H2O/CH3CN gacha (gradient), 35–45 daqiqa: 90% H2O/EtOH, 45–155 daqiqa: 90% H2O/EtOH dan 100% EtOH gacha (gradient (gradient), 155–200 daqiqa: 100% EtOH) 1,5 ml/min oqim tezligida, kumamonamid (1,36,0 mg) oq amorf kukun sifatida ajratib olindi.
Kumamotoamid(1); 1H-NMR (500 MGts, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t, J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MGts, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ hisoblangan qiymati: 141.0659, o'lchangan qiymati: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 sm–1.
Kolumbiya urug'lari (Col-0) tadqiqot uchun ruxsatnoma bilan Arabidopsis Biologik Resurs Markazi (ABRC) dan olingan. Col-0 urug'lari laboratoriya sharoitimizda ko'paytirildi va saqlandi hamda yovvoyi turdagi Arabidopsis o'simliklari sifatida ishlatildi. Arabidopsis urug'lari sirt sterilizatsiya qilindi va 2% saxaroza (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0,05% (w/v) 2-(4-morfolino)etanesulfon kislotasi (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical) va 1,5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH qiymati 5,7 bo'lgan yarim kuchli Murashige va Skoog muhitida, 23 °C haroratda va doimiy yorug'likda yetishtirildi. phs1-1 mutantining urug'lari T. Hashimoto (Nara Fan va Texnologiya Instituti) tomonidan taqdim etildi.
SR-1 shtammining urug'lari T. Hashimoto (Nara Fan va Texnologiya Instituti) tomonidan taqdim etildi va yovvoyi turdagi tamaki o'simliklari sifatida ishlatildi. Tamaki urug'lari sirt sterilizatsiya qilindi va unib chiqishini rag'batlantirish uchun uch kecha davomida steril suvda namlandi, so'ngra pH qiymati 5,7 bo'lgan 2% saxaroza, 0,05% (w/v) MES va 0,8% gellan saqichi (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige va Skoog muhiti) bo'lgan yarim kuchli eritmaga joylashtirildi va doimiy yorug'lik ostida 23°C da inkubatsiya qilindi.
Tak-1 shtammi T. Kohchi (Kyoto universiteti) tomonidan taqdim etildi va jigar o'simligini o'rganish uchun standart tajriba birligi sifatida ishlatildi. Gemma sterilizatsiya qilingan o'simliklardan olindi va keyin 1% saxaroza va 0,3% gellan saqichini o'z ichiga olgan Gamborg B5 muhitiga (Fujifilm Wako Pure Chemical) qo'shildi va 23°C da doimiy yorug'lik ostida inkubatsiya qilindi.
Tamaki BY-2 hujayralari (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) S. Hasezawa (Tokio universiteti) tomonidan taqdim etildi. BY-2 hujayralari modifikatsiyalangan Linsmeier va Skoog muhitida 95 marta suyultirildi va haftasiga 2,4-dixlorfenoksiatsetik kislota 32 bilan to'ldirildi. Hujayra suspenziyasi qorong'ida 27°C da 130 rpm tezlikda aylanuvchi silkitgichda aralashtirildi. Hujayralarni yangi muhit hajmidan 10 baravar ko'p miqdorda yuving va xuddi shu muhitda qayta suspenziya qiling. Gulkaram mozaikasi virusi 35S promotori ostida mikrotubula marker TagRFP-TUA6 yoki aktin filament marker GFP-ABD2 ni barqaror ifodalovchi BY-2 transgen hujayra liniyalari tasvirlanganidek yaratildi33,34,35. Ushbu hujayra liniyalari asl BY-2 hujayra liniyasi uchun qo'llaniladigan protseduralarga o'xshash protseduralar yordamida saqlanishi va sinxronlashtirilishi mumkin.
HeLa hujayralari 37°C haroratda 5% CO2 bilan inkubatorda 10% homila sigir zardobi, 1,2 U/ml penitsillin va 1,2 mkg/ml streptomitsin qo'shilgan Dulbecco modifikatsiyalangan Eagle's muhitida (DMEM) (Life Technologies) yetishtirildi.
Ushbu qo'lyozmada tasvirlangan barcha tajribalar Yaponiya bioxavfsizlik qoidalari va ko'rsatmalariga muvofiq amalga oshirildi.
Birikmalar dimetil sulfoksidda (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) asosiy eritmalar sifatida eritildi va Arabidopsis va tamaki uchun MS muhitida yoki jigar o'ti uchun Gamborg B5 muhitida suyultirildi. Ildiz o'sishini inhibe qilish tahlili uchun har bir plastinkada 10 dan ortiq urug'lar ko'rsatilgan birikmalar yoki DMSO ni o'z ichiga olgan agar muhitiga ekildi. Urug'lar o'sish kamerasida 7 kun davomida inkubatsiya qilindi. Ko'chatlar suratga olindi va ildizlarning uzunligi o'lchandi. Arabidopsisning unib chiqishini tahlil qilish uchun har bir plastinkada 48 ta urug' 200 μM birikma yoki DMSO ni o'z ichiga olgan agar muhitiga ekildi. Arabidopsis urug'lari o'sish kamerasida o'stirildi va unib chiqqan ko'chatlar soni unib chiqqandan 7 kun o'tgach (dag) hisoblandi. Tamaki unib chiqishini tahlil qilish uchun har bir plastinkada 24 ta urug' 200 μM KAND yoki DMSO ni o'z ichiga olgan agar muhitiga ekildi. Tamaki urug'lari o'sish kamerasida o'stirildi va unib chiqqan ko'chatlar soni 14 kundan keyin hisoblandi. Jigar o'simligi o'sishini inhibe qilish tahlili uchun har bir plastinkadan 9 ta embrion ko'rsatilgan KAND yoki DMSO konsentratsiyalarini o'z ichiga olgan agar muhitiga joylashtirildi va o'sish kamerasida 14 kun davomida inkubatsiya qilindi.
Ildiz meristemasining tuzilishini ko'rish uchun 5 mg/ml propidiy yodid (PI) bilan bo'yalgan ko'chatlardan foydalaning. PI signallari TCS SPE konfokal lazer skanerlash mikroskopi (Leica Microsystems) yordamida lyuminestsent mikroskopiya yordamida kuzatildi.
Ildizlarni β-glyukuronidaza (GUS) bilan gistokimyoviy bo'yash Malami va Benfey36 tomonidan tasvirlangan protokolga muvofiq amalga oshirildi. Ko'chatlar bir kecha davomida 90% asetonda fiksatsiya qilindi, GUS buferidagi 0,5 mg/ml 5-bromo-4-xloro-3-indolil-β-d-glyukuronik kislota bilan 1 soat davomida bo'yaldi va gidratlangan xloraldegid eritmasiga (8 g xloral gidrat, 2 ml suv va 1 ml glitserin) joylashtirildi va Axio Imager M1 mikroskopi (Carl Zeiss) yordamida differentsial interferentsiya kontrastli mikroskopiya yordamida kuzatildi.
Ildiz burchaklari vertikal joylashtirilgan plastinkalarda o'stirilgan 7 kunlik ko'chatlarda o'lchandi. Ildiz burchagini 6-bosqichda tasvirlanganidek, tortishish vektori yo'nalishi bo'yicha o'lchang.
Kortikal mikrotubulalarning joylashuvi tavsiflanganidek kuzatildi, protokolga kichik o'zgartirishlar kiritildi 37. Anti-β-tubulin antitelosi (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) va Alexa Fluor 488 bilan konjuge qilingan sichqonlarga qarshi IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) mos ravishda 1:1000 va 1:100 suyultirishlarda birlamchi va ikkilamchi antitelolar sifatida ishlatilgan. Floresan tasvirlari TCS SPE konfokal lazer skanerlash mikroskopi (Leica Microsystems) yordamida olingan. Z-stack tasvirlarini oling va ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq maksimal intensivlik proektsiyalarini yarating.
HeLa hujayralarining ko'payishi tahlili ishlab chiqaruvchining ko'rsatmalariga muvofiq hujayralarni hisoblash to'plami 8 (Dojindo) yordamida amalga oshirildi.
E. coli DH5α ning o'sishi 600 nm (OD600) da spektrofotometr yordamida madaniyatdagi hujayra zichligini o'lchash orqali tahlil qilindi.
Transgen BY-2 hujayralarida sitoskelet tuzilishi CSU-X1 konfokal skanerlash moslamasi (Yokogawa) va sCMOS kamerasi (Zyla, Andor Technology) bilan jihozlangan lyuminestsent mikroskop yordamida kuzatildi. Sitoskelet zichligi tasvir tahlili orqali baholandi, bu tasvirlanganidek ImageJ dasturi yordamida konfokal tasvirlardagi sitoplazmatik piksellar orasidagi sitoskelet piksellarining foizini aniqladi38,39.
BY-2 hujayralarida hujayra o'limini aniqlash uchun hujayra suspenziyasining bir qismi xona haroratida 10 daqiqa davomida 0,05% Evans ko'ki bilan inkubatsiya qilindi. O'lik hujayralarni tanlab Evans ko'kiga bo'yash bo'yoqning butun plazma membranasi tomonidan yashovchan hujayralardan chiqarilishiga bog'liq40. Bo'yalgan hujayralar yorqin maydonli mikroskop (BX53, Olympus) yordamida kuzatildi.
HeLa hujayralari 37°C va 5% CO2 da namlangan inkubatorda 10% FBS qo'shilgan DMEMda o'stirildi. Hujayralar 37°C da 6 soat davomida 100 μM KAND 11, kumamonamik kislota 6, kumamonamid 1, 100 ng/ml kolsemid (Gibco) yoki 100 ng/ml Nokodmaze (Sigma) bilan ishlov berildi. Hujayralar xona haroratida 10 daqiqa davomida MetOH bilan, keyin esa 5 daqiqa davomida asetat bilan fiksatsiya qilindi. Fiksatsiyalangan hujayralar 0,5% BSA/PBS da suyultirilgan β-tubulin birlamchi antitelosi (1D4A4, Proteintech: 66240-1) bilan 2 soat davomida inkubatsiya qilindi, TBST bilan 3 marta yuvildi va keyin Alexa Fluor echki antitelosi bilan inkubatsiya qilindi. 488 1 soat. – Sichqoncha IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) va 0,5% BSA/PBS da suyultirilgan 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). TBST bilan uch marta yuvilgandan so'ng, bo'yalgan hujayralar Nikon Eclipse Ti-E teskari mikroskopida kuzatildi. Tasvirlar MetaMorph dasturi (Molecular Devices) yordamida sovutilgan Hamamatsu ORCA-R2 CCD kamerasi bilan olingan.
Nashr vaqti: 2024-yil 17-iyun